如何用外泌体「套路」申请关于国自然？

最近一段时间正是国自然标书撰写进入最后的冲刺阶段，相信很多科研工作者们都已经拟好内容，只差润色了。但是不知道这两年的国自然一线明星外泌体，大家的内容里都靠上了没？如果想靠但还没有靠上的，需要抓紧时间了啊，还剩下最后的补实验基础的时间。下面我为大家将外泌体的知识再梳理一遍：

在说外泌体之前，我们先介绍一下细胞外囊泡（Extracellular Vesicles， EVs）。细胞外囊泡是细胞以多种形式分泌到细胞外的各种囊泡：外泌体（Exosomes）直径为 30-150 nm，以内吞的形式释放到细胞外；微囊泡（Microvesicles）直径为 100-1000 nm，以出芽的形式释放到细胞外；凋亡小体（Apoptotic body）直径为 50-2000 nm，由凋亡细胞产生。由于各种胞外囊泡的大小可能有交叉，所以要想通过分离手段得到某种纯化的特定囊泡是很难实现的。

图一 胞外囊泡的分泌 （图片来源于文献）

外泌体携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类和核酸，其中蛋白质包括跨膜蛋白、信号转导蛋白、细胞支架蛋白、酶等，现在很多文献会选择其中的几种膜蛋白和膜内蛋白作为外泌体的鉴定标志物，核酸包括 DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA 等，这些组分参与了细胞的各种代谢以及生理活动的变化。

图二 外泌体组分分布（图片来源于网络）

一、为什么要研究外泌体？

外泌体是细胞与细胞间通讯中起关键作用的胞外基质成分，广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动；同时，外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫调节作用和诱导正常细胞转化，促进肿瘤发生及转移的作用；此外，外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送，装载的药物类型包括小分子化学药物、蛋白质和肽、核酸药物等。

二、外泌体相关数据库有哪些？

• exoRBase（http://www.exoRBase.org）数据库收集和描述人类血液外泌体中所有长的 RNA，提供了注释、表达水平和可能的来源组织。

• EVpedia（http://student4.postech.ac.kr/evpedia2_xe/xe/）数据库汇总了不同囊泡研究中发现的蛋白、mRNA、miRNA、脂类等。

• Vesiclepedia（http://microvesicles.org/index.html）数据库不仅收录了外泌体中的脂质、RNA 和蛋白质，还有微囊泡、凋亡小体等囊泡类型的信息。

• ExoCarta（http://exocarta.org/index.html）数据库主要收录了包括人、大鼠、小鼠、绵羊、豚鼠、果蝇、马、穴兔、牛在内的几个物种的 286 个研究结果，含蛋白质、mRNA、miRNA 和脂质等信息。

三、如何获得外泌体样本及预处理？

外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。不同的样本来源，预处理及注意细节均不同，下面我们选取几种常见的样本分别介绍样本处理的要求：

细胞培养上清：选用这种样本的优势是不会受到样本量的限制，但是需要注意以下几点：一是一定不能添加含有外泌体的 FBS；二是细胞一般培养 24-48h 后即可分离外泌体；三是注意细胞不允许有污染、细胞死亡率要控制在 5% 之内。

血清/血浆：选用血液作为样本时，要注意血清和血浆的区别。血清是血液凝固之后收集的液体，如果研究与血小板相关的疾病，选用血清作为样本比较合适；血浆是血液去除了血细胞之后得到的液体，一般情况下选择血浆更合适。尽量在采血 30min 内处理样本，同时还应注意采血的针头大小以及取样的定点定时。

尿液：选用尿液作为样本时，一方面要注意选取中间段的尿液，确保尿液的新鲜度；另一方面收集样本后，要添加硫柳汞钠抑菌剂，防止尿液被污染。

卵泡液：生殖系统的样本是现在外泌体研究的一个重要系统，在不同的生理状态下卵泡液分泌的外泌体内容物会有不同。卵泡液的粘度比较大，分离难度相对大一点，在分离之前可能需要先浓缩。

脑脊液：神经系统这块目前有很多科研人员在用外泌体做功能和机制研究，其中脑脊液是神经系统做外泌体选择的比较合适的样本，但是脑脊液由于很难获得，一定程度上限制了外泌体在神经系统中的应用。

乳汁：乳汁中会分泌一些外泌体，供新生儿吸收。乳汁中的外泌体受母亲的膳食、健康状况、精神状态等影响比较大。此外，乳汁中含有的大量脂蛋白会影响外泌体的分离。

关节积液：骨科的外泌体研究项目越来越多，那么关节积液也是经常遇见的一种需要分离外泌体的样本。关节积液的外泌体含量不高，但是获得量容易受限制。

图三 样本来源示意图

四、如何分离外泌体？

我们可以通过不同的分离方法从生物体液中进行外泌体分离，下面选取几种方法分别做介绍：

差速超速离心：差速超速离心是大家最熟悉的一种分离方法，文献中用得最多的且也是目前比较能受到认可的方法。差速超速离心是先通过低速离心去除细胞和细胞凋亡碎片，再通过超高速去除大囊泡和沉淀外泌体。此方法分离得到的外泌体可用于后续的鉴定实验、分子检测实验、细胞实验和动物实验。

密度梯度离心：此方法多指蔗糖密度梯度超速离心。此方法从不同密度的颗粒中分离出囊泡，对离心的时间比较敏感。如果外泌体和颗粒密度相似，外泌体可能会被其他颗粒污染。

超滤：超滤过程中需要用超滤膜进行外泌体隔离。在分离过程中，外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。同时，外泌体会粘附在膜上，导致产量降低。

免疫磁珠法：用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。该方法分离得到的外泌体的生物活性易受 pH 和盐浓度影响，不利于下游实验。

试剂盒分离法：目前商业化的外泌体提取试剂盒多种多样，提取效果良莠不齐。同时试剂盒本身的价格比较高，且外泌体的得率和纯度一般，不是性价比高的一种分离方法。此方法得到的外泌体对于后续的鉴定实验、细胞实验和动物实验等可能有影响。

五、如何鉴定外泌体？

外泌体分离之后，需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物，多角度进行鉴定。下面介绍几种鉴定方法：

透射电镜鉴定法：透射电镜，全称为透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称 TEM），分辨率为 0.1~0.2 nm，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，用于鉴定样本中是否存在外泌体样结构，即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。

图四 外泌体电镜图

浓度粒径检测法：纳米颗粒跟踪分析法，简称 NTA（Nanoparticle Tracking Analysis），该技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一。NTA 技术的样本处理简单、能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。

图五 外泌体 NTA 图

Western Blot 分子标志物检测： WB 可以用来鉴定外泌体的标志蛋白是否存在于样本中。外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如 CD9、CD63 和 CD81；细胞质蛋白，如肌动蛋白（Actin）和钙磷脂结合蛋白（Annexins）；参与生物功能的分子，如凋亡转接基因 2 互作蛋白 X（ALIX）、肿瘤易感基因 101 蛋白（TSG101）、热休克蛋白（HSP70、HSP90），以及细胞分泌的特异性蛋白。其中 CD9、CD63、HSP70、TSG101 是外泌体常用的鉴定蛋白。

流式细胞术检测：外泌体可以先进行荧光标记，再通过流式细胞仪检测外泌体表面标记蛋白。但是传统的流式细胞仪检测样本的颗粒大小是 300-500 nm，而外泌体直接都在 300 nm 以下，因此，可能大量的外泌体检测不到，造成分析不太准确。

ELISA 检测 ：根据外泌体的表面标志物，如 CD9、CD63 进行 ELISA 实验，来检测外泌体的蛋白量，从而实现对外泌体的分析。但是 ELISA 方法容易受其他抗原的干扰，引起实验结果出现偏差。

六、如何检测和研究外泌体？

外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸，可通过细胞膜受体直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。

通过高通量技术对外泌体 RNA 进行分析，可快速高效获得外泌体 RNA 的全面信息。不同细胞来源的外泌体所含有的 RNA 和蛋白成分不太相同，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。

外泌体 microRNA 测序/芯片：通过对外泌体 microRNA 的高通量分析，可以找到不同外泌体之间差异表达的 microRNA，为后续的功能学实验做准备。

外泌体 mRNA 测序/芯片：通过对外泌体转录组测序或表达谱芯片分析，可以找出不同外泌体之间差异表达的 mRNA，从而发现外泌体中哪些基因发生了变化。

外泌体 lncRNA 芯片：通过 lncRNA 芯片可以同时得到 lncRNA 和 mRNA 数据，为研究者提供更完整的 lncRNA 和 mRNA 筛查。

外泌体 ceRNA 芯片：竞争性内源 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）机制如下：microRNA（miRNA）处在调控网络的中心，lncRNA 分子富含 miRNA 结合位点，可以竞争性地结合 miRNA，解除 miRNA 对其靶基因的抑制作用，进而调控基因的表达水平。通过 ceRNA 芯片可以为研究者提供完整的 lncRNA，circRNA 和 mRNA 筛查。

外泌体蛋白质组学：主要包括 iTRAQ 蛋白质组定量/ TMT 标记定量蛋白质组学/label free 蛋白质组定量。通过蛋白质组学分析，寻找差异表达蛋白，并揭示其细胞生理病理功能。

外泌体的研究方向主要包括以下三个方面：

1.寻找疾病诊断和预后的分子标志物。

2.揭示疾病发病机制，从微环境角度解释细胞之间通讯促进疾病发生的原因。

3.外泌体作为药物载体，实现靶向给药。