外泌体载药研发新突破：小 RNA 的新武器
和元生物
外泌体（Exosomes）是细胞分泌到胞外的一种囊泡，大小为 30-150 nm，携带了各种核酸、蛋白质和脂类等物质，可以在不同细胞间进行传递和交流，从而影响受体细胞的生物学功能。
外泌体在大小和功能上与合成的纳米颗粒类似，但作为天然内源性载体，具有免疫原性低、毒性低、稳定性高、渗透性好等优势，故可能成为更有应用前景的药物递送载体。目前，外泌体已经成功运载基因类药物、抗癌药物和抗炎症药物等其他类型药物。
1.安全：从患者体内获取的外泌体，经载入基因后，再注入患者体内几乎不会引起免疫反应，更加安全；
2.保护性强：外泌体粒径较小，可以逃过网状内皮系统的捕捉，有效保护承载的基因；
3.运载效率高：外泌体可以通过与受体细胞膜融合的方式，将基因类药物释放到细胞质中。
近期，和元生物研发团队展示了他们在外泌体载药上的研发进展，分别用电转法和共孵育法做了 miRNA 和 siRNA 两部分装载的探索。根据数据结果显示，相比共孵育法，电转法能更有效地将 miRNA 和 siRNA 这些小 RNA 载入到外泌体中，这为后续验证 miRNA 和 siRNA 对体内外功能的影响奠定了基础。下面具体介绍实验过程和结果。
一、外泌体载药之 miRNA 装载篇
图一 外泌体 miRNA 装载及检测示意图
1.实验结果：
1)外泌体超离后，根据透射电镜（TEM）、NTA 和 WB 的鉴定结果，我们获得了高质量的外泌体，用于后续电转和共孵育实验。
图二 外泌体鉴定（TEM、NTA、WB）
2)外泌体经电转和共孵育后，通过 qPCR 方法检测外泌体中 miR-21-5p 的水平，数据显示，电转后外泌体中 miR-21-5p 的水平显著高于共孵育后 miR-21-5p 的水平。
图三 qPCR检测外泌体中 miR-21-5p 含量
图四 外泌体电转和共孵育转染荧光对比
4)从检测目的细胞中 miR-21-5p 的 RNA 水平可以看出，与上述转染结果一致，通过电转法将 miR-21-5p 转载入外泌体中，再用此外泌体转染目的细胞，发现目的细胞中 miR-21-5p RNA 水平显著高于用共孵育法带来的 RNA 水平变化。
图五 qPCR 检测外泌体电转和共孵育对目的细胞中 miR-21-5p RNA 水平的影响
2.实验讨论：
基于本次的实验数据，我们可以看出，用电转法将 miRNA 转载入外泌体中是切实可行的，且效率要远高于用共孵育法。但是需要注意的是，不同批次不同来源的外泌体，其电转效率有差异，同时不同细胞摄取外泌体的能力不同，因此使用不同批次不同来源的外泌体电转时，需要做外泌体和 miRNA 梯度预实验确定以外泌体和 miRNA 的最佳使用量。
二、外泌体载药之 siRNA 装载篇
1.实验结果：
1) 通过 qPCR 法检测电转组和共孵育组外泌体中 siRNA 水平，数据结果显示，电转组的 RNA水平显著高于共孵育组，表明 siRNA 通过电转进入外泌体的效率较高。
图六 qPCR 检测电转组和共孵育组外泌体中 siRNA 水平
2) 从细胞中外泌体的荧光情况看，电转组里除了外泌体本身的绿色，还有 Bcl-2 siRNA 的红色标记，说明 Bcl-2 siRNA 通过电转被装载入外泌体中；而共孵育组中基本没有摄入 Bcl-2 siRNA，故通过电转法能将 siRNA 有效地装进外泌体中。
图七 电转组和共孵育组与细胞共培养24h后观察外泌体荧光情况
3)通过共聚焦显微镜观察电转组外泌体中 siRNA 的载入情况，从共聚焦显微镜拍摄的结果看，电转组外泌体中有进入了大量的 Bcl-2 siRNA。
图八 共聚焦显微镜检测外泌体中 siRNA 装载情况
通过本次实验数据可以看出，对于 siRNA 的外泌体装载，电转法装载的效率较高。后续实验可以进一步检测细胞中 siRNA 引起的基因水平变化，以及对应的细胞功能学的变化。未来的实验结果，我们拭目以待！
