材料与仪器
DEPC 处理水。 l.0mol LTris 溶液 (PH7.5) TE 缓冲液 含 0.1%SDS 的 TE 缓冲液 20% 十二烷基苯磺酸钠 匀浆缓冲液 氯化铯溶液 3mol L 乙酸钠 (pH5.2) 无水乙醇 乙醇
Brinkmann 匀浆器 BeckmannL8-80 离心机
Brinkmann 匀浆器 BeckmannL8-80 离心机
步骤
一 材料与设备
所有的缓冲液配制均需采用经过蒸馏并灭菌的去离子水。
1)DEPC 处理水。
2)l.0mol/LTris 溶液 (PH7.5), 使用 DEPC 处理并高压灭菌过的水配制, 但 Tris 溶液不能用 DEPC 处理。
3)TE 缓冲液，
4) 含 0.1%SDS 的 TE 缓冲液，
5)20% 十二烷基苯磺酸钠。配制时加入 DEPC 至终浓度 0.1%，振荡混匀，37°C 过夜，高压消毒 20 min 以破坏 DEPC。
6) 匀浆缓冲液：4.Omol/L 异硫氰酸胍，0.1mol/LTris(pH7.5)。配好后，用已灭菌的滤器除去颗粒状物质。使用前，加β-巯基乙醇至终浓度 1%.
7) 氯化铯溶液：由 5.7mol/LCsCl 和 0.Olmol/LEDTA(pH8.0) 组成。配制时，将 96 gCsCl 和 2 ml0.5mol/LEDTAC(pH8.0) 溶于约 70 mlddH20 中，定容至 100 ml，并使用消毒的滤器除去颗粒状物质，将溶液转入瓶中，并仔细标记凹液面的位置。加人 DEPC 至终浓度 0.1%，振荡混匀，37°C 孵育过夜。最后，高压消毒 20 min 以破坏 DEPC. 高压消毒后，由丁蒸发，溶液的体积会变小。加入 DEPC 处理过的水至标记的凹液向处，以补足溶液，混匀
8)3mol/L 乙酸钠 (pH5.2)。配制时加入 DEPC 至终浓度 0.1%，振荡混匀，37℃ 过夜，高压消毒 20 min 以破坏 DEPC.
9) 无水乙醇。
10) 无 RNase 污染的 70% 乙醇。
11)Brinkmann 匀浆器
12)BeckmannL8-80 离心机。
二 操作方法
1) 在 50 ml 离心管中加入 1〜5 ml 的虫体悬浮物（50% 的虫体溶于 0.lmol/lNaCl中), 如虫体悬浮物多于 5 ml, 匀浆时悬浮物将会溢出。最好使用新鲜制备的线虫或新鲜冷冻并储于-80°C 的线虫
2) 使用电动组织匀浆器裂解虫体。匀浆在能使 RNase 失活的变性液中快速进行，以使 RNA 的降解最彻底
3) 向新鲜线虫悬浮液中加入 5 倍体积的匀浆缓冲液（匀浆缓冲液中应加入β-巯基乙醇），立即开始勻浆. 如是冷冻的线虫，可将缓冲液直接加在冷冻线虫上. 立即开始匀浆。匀浆开始时应将勻浆器凋到较低转速并将钴头插入冷冻的线虫中. 以使其被打碎并从试管底部悬浮起来。一旦大块的冷冻物被分散后，应马上将匀浆器开到最大速并勻浆2 min
4) 加入十二烷基苯磺酸钠溶液至终浓度为 0.5%，混匀。
5) 将混合物置于 28 ml 的离心管中，以 30OOOr/min 于 20℃ 离心 20 min，以除去沉淀。然后，将上清移至一洁净的 50 ml 离心管中。此时，上清应呈黄褐色。
6) 每 6 ml 的匀浆产物应准备-个氯化铯的密度梯度。最好使用可以在 SW28.1 转头中使用的无 RNase 污染的 16 mmX102 mm 的polyallomar 离心管，而不要使用 ultraclear 离心管，因为后者在离心中极易破裂, 用塑料移液管向每个离心管中加入 11.5 ml 的氯化铯溶液，并且轻敲管壁以除去溶液中可能沾在管壁上的气泡。
7) 将线虫匀浆产物吸入装有 23 号标准针头的 5 ml 注射器中，并将其沿离心宵壁轻轻铺于氯化铯密度梯度的表面直至距管 U1〜2 mm 处。每管可加入约 8 ml 的匀浆产物，如匀浆产物没能装满一管. 可用含 0.5% 十二烷基苯磺酸钠的匀浆缓冲液补足。用记号笔在氯化铯溶液和匀浆产物之间的接触面上做一标记。
8) 小心的将离心管放到 SW28.1 离心桶中，拧紧盖子，并将离心桶装到超高速离心机的转头上 (在此过程中应吋刻注意不要将氯化铯密度梯度打乱）。于 20℃ 以 27000r/min 离心离心时，不要使用快加速和刹乍减速，尽可能的不破坏氯化铯密度梯度。实际操作时，可视具体情况将离心时问加长或缩短。
9) 离心结束后，小心的将离心管移到一离心管架上 (注意不要将梯度破坏）。褐色的蛋白应仍在记号笔所做标记之上，并且在此褐色物质中应有一条白色的双环状带。在氯化铯密度梯度的澄清部分应有另_一个白色条带，这是线虫 DNA。RNA 应为松散的吸附在离心管的底部的透明物质只有将几乎所有的液体去掉以后，RNA 才能肴得到），这些 RNA 团块看起来像体积约 30ul 的一块块薄薄的没冇光泽的低熔点琼脂糖。
10) 除去液体需要极大的耐心，既要避免氯化铯密度梯度中的上层物质污染 RNA,又要防止丟失很难看阽的 RNA 团块。用 10 ml 的塑料移液管和橡胶吸球小心的吸取上层物质直至记号笔标记处。在吸取液体时，应使吸管口紧贴在液面上，目的是使液体和空气一同被吸上来，以确保在梯度顶端的密度最小的物质也是最具有污染性的物质）首先被除去，这样在下层的液体被吸出时它们不会随之落下。换一新移液管，以相同方式吸取更多的液体直至环状 DNA 条带的下侧。再换另一新移液管，吸出余下的大部分液体。最后留下约 2 ml 液体，使之刚好盖过离心管弓形的底部，余下的液体应被极其谨慎的吸出以防止 RNA 的损失。
11) 用镊子取一洁净手术刀片于本生炉上灼烧直至其变红，然后用其切割（实际上是熔化) 离心管。切割点应恰好在剩余的液体的液面上端。在离心管上部和底部切割分离时，应保留一小段两者连接的部分，这样离心管底部可以很方便的以其上部为柄而被拿起。除去离心管上部的 0 的有二：其一，使上部污染的管壁与无污染的底部分开；其二，可以有助千看清底部的 RNA 团块
12) 用无 RNase 污染的 20ul 的移液器非常小心的移出剩余的液体。此时，呈凝胶状的透明 RNA 团块可能以漂浮状或是片状存在。实验时，将管底向四周倾斜有助于液体与 RNA 小球的分离，以便将液体安全吸出。有时能将最后的约 30ul 的液体吸出却丝毫不吸出 RNA 几乎是不可能的。在这种情况下，应留下最后的一点液体 T 并加人约两倍体积的室温的无水乙醇 (无 RNase)。这将会使剩余的氣化铯与 RNA—起形成白色的沉淀，并且更好沾在离心管的底部。接下来可继续进行下一步骤 (将管中加满 70% 的乙醇) 所有残余的氯化铯最终将会在下-步的乙醇沉淀中被除去。
13) 向离心管的底部加满室温的 70% 的乙醇。此步可将剩余的氯化铯浸出，而 RNA 将会在两分钟之后变成白色，并且会更紧密的附着在管壁上。
14) 倒掉或吸出剩余的液体，然后对 RNA 沉淀进行短时的干燥。当 RNA 开始变得透明时，向每个离心管中加入 175ul 含 0.1%SDS 的 TE 溶液，用移液器上下反复吹打，以悬浮和溶解 RNA。此过程应持续 1mim。之后，将 RNA 转移到一个新的无 RNase 污染的带有螺旋盖的离心管中，并向原离心管中再加入 25ul 含 0.1%SDS 的 TE 溶液，吹打几次。最后将两部分 RNA 溶液合并。如 RNA 仍没有完全溶解有时有一些小块残留），可将其冻在液氮中然后在 50℃ 水浴中解冻，反复一到两次，可使 RNA 完全溶解。
15) 对于 200ul 的 RNA 溶液，加入 150ulTE,30ul3nol/L 乙酸钠 (pH5.2) 和 900UL乙醇，以沉淀 RNA. 于-2O℃3Omin.4℃ 离心 lOmin。弃上清，用 70% 乙醇冲洗沉淀，干燥，用少量的水溶解 RNA(—般大约 80ul，具体依 RNA 量的多少而定）。
16) 将 RNA 储存在-80℃
所有的缓冲液配制均需采用经过蒸馏并灭菌的去离子水。
1)DEPC 处理水。
2)l.0mol/LTris 溶液 (PH7.5), 使用 DEPC 处理并高压灭菌过的水配制, 但 Tris 溶液不能用 DEPC 处理。
3)TE 缓冲液，
4) 含 0.1%SDS 的 TE 缓冲液，
5)20% 十二烷基苯磺酸钠。配制时加入 DEPC 至终浓度 0.1%，振荡混匀，37°C 过夜，高压消毒 20 min 以破坏 DEPC。
6) 匀浆缓冲液：4.Omol/L 异硫氰酸胍，0.1mol/LTris(pH7.5)。配好后，用已灭菌的滤器除去颗粒状物质。使用前，加β-巯基乙醇至终浓度 1%.
7) 氯化铯溶液：由 5.7mol/LCsCl 和 0.Olmol/LEDTA(pH8.0) 组成。配制时，将 96 gCsCl 和 2 ml0.5mol/LEDTAC(pH8.0) 溶于约 70 mlddH20 中，定容至 100 ml，并使用消毒的滤器除去颗粒状物质，将溶液转入瓶中，并仔细标记凹液面的位置。加人 DEPC 至终浓度 0.1%，振荡混匀，37°C 孵育过夜。最后，高压消毒 20 min 以破坏 DEPC. 高压消毒后，由丁蒸发，溶液的体积会变小。加入 DEPC 处理过的水至标记的凹液向处，以补足溶液，混匀
8)3mol/L 乙酸钠 (pH5.2)。配制时加入 DEPC 至终浓度 0.1%，振荡混匀，37℃ 过夜，高压消毒 20 min 以破坏 DEPC.
9) 无水乙醇。
10) 无 RNase 污染的 70% 乙醇。
11)Brinkmann 匀浆器
12)BeckmannL8-80 离心机。
二 操作方法
1) 在 50 ml 离心管中加入 1〜5 ml 的虫体悬浮物（50% 的虫体溶于 0.lmol/lNaCl中), 如虫体悬浮物多于 5 ml, 匀浆时悬浮物将会溢出。最好使用新鲜制备的线虫或新鲜冷冻并储于-80°C 的线虫
2) 使用电动组织匀浆器裂解虫体。匀浆在能使 RNase 失活的变性液中快速进行，以使 RNA 的降解最彻底
3) 向新鲜线虫悬浮液中加入 5 倍体积的匀浆缓冲液（匀浆缓冲液中应加入β-巯基乙醇），立即开始勻浆. 如是冷冻的线虫，可将缓冲液直接加在冷冻线虫上. 立即开始匀浆。匀浆开始时应将勻浆器凋到较低转速并将钴头插入冷冻的线虫中. 以使其被打碎并从试管底部悬浮起来。一旦大块的冷冻物被分散后，应马上将匀浆器开到最大速并勻浆2 min
4) 加入十二烷基苯磺酸钠溶液至终浓度为 0.5%，混匀。
5) 将混合物置于 28 ml 的离心管中，以 30OOOr/min 于 20℃ 离心 20 min，以除去沉淀。然后，将上清移至一洁净的 50 ml 离心管中。此时，上清应呈黄褐色。
6) 每 6 ml 的匀浆产物应准备-个氯化铯的密度梯度。最好使用可以在 SW28.1 转头中使用的无 RNase 污染的 16 mmX102 mm 的polyallomar 离心管，而不要使用 ultraclear 离心管，因为后者在离心中极易破裂, 用塑料移液管向每个离心管中加入 11.5 ml 的氯化铯溶液，并且轻敲管壁以除去溶液中可能沾在管壁上的气泡。
7) 将线虫匀浆产物吸入装有 23 号标准针头的 5 ml 注射器中，并将其沿离心宵壁轻轻铺于氯化铯密度梯度的表面直至距管 U1〜2 mm 处。每管可加入约 8 ml 的匀浆产物，如匀浆产物没能装满一管. 可用含 0.5% 十二烷基苯磺酸钠的匀浆缓冲液补足。用记号笔在氯化铯溶液和匀浆产物之间的接触面上做一标记。
8) 小心的将离心管放到 SW28.1 离心桶中，拧紧盖子，并将离心桶装到超高速离心机的转头上 (在此过程中应吋刻注意不要将氯化铯密度梯度打乱）。于 20℃ 以 27000r/min 离心离心时，不要使用快加速和刹乍减速，尽可能的不破坏氯化铯密度梯度。实际操作时，可视具体情况将离心时问加长或缩短。
9) 离心结束后，小心的将离心管移到一离心管架上 (注意不要将梯度破坏）。褐色的蛋白应仍在记号笔所做标记之上，并且在此褐色物质中应有一条白色的双环状带。在氯化铯密度梯度的澄清部分应有另_一个白色条带，这是线虫 DNA。RNA 应为松散的吸附在离心管的底部的透明物质只有将几乎所有的液体去掉以后，RNA 才能肴得到），这些 RNA 团块看起来像体积约 30ul 的一块块薄薄的没冇光泽的低熔点琼脂糖。
10) 除去液体需要极大的耐心，既要避免氯化铯密度梯度中的上层物质污染 RNA,又要防止丟失很难看阽的 RNA 团块。用 10 ml 的塑料移液管和橡胶吸球小心的吸取上层物质直至记号笔标记处。在吸取液体时，应使吸管口紧贴在液面上，目的是使液体和空气一同被吸上来，以确保在梯度顶端的密度最小的物质也是最具有污染性的物质）首先被除去，这样在下层的液体被吸出时它们不会随之落下。换一新移液管，以相同方式吸取更多的液体直至环状 DNA 条带的下侧。再换另一新移液管，吸出余下的大部分液体。最后留下约 2 ml 液体，使之刚好盖过离心管弓形的底部，余下的液体应被极其谨慎的吸出以防止 RNA 的损失。
11) 用镊子取一洁净手术刀片于本生炉上灼烧直至其变红，然后用其切割（实际上是熔化) 离心管。切割点应恰好在剩余的液体的液面上端。在离心管上部和底部切割分离时，应保留一小段两者连接的部分，这样离心管底部可以很方便的以其上部为柄而被拿起。除去离心管上部的 0 的有二：其一，使上部污染的管壁与无污染的底部分开；其二，可以有助千看清底部的 RNA 团块
12) 用无 RNase 污染的 20ul 的移液器非常小心的移出剩余的液体。此时，呈凝胶状的透明 RNA 团块可能以漂浮状或是片状存在。实验时，将管底向四周倾斜有助于液体与 RNA 小球的分离，以便将液体安全吸出。有时能将最后的约 30ul 的液体吸出却丝毫不吸出 RNA 几乎是不可能的。在这种情况下，应留下最后的一点液体 T 并加人约两倍体积的室温的无水乙醇 (无 RNase)。这将会使剩余的氣化铯与 RNA—起形成白色的沉淀，并且更好沾在离心管的底部。接下来可继续进行下一步骤 (将管中加满 70% 的乙醇) 所有残余的氯化铯最终将会在下-步的乙醇沉淀中被除去。
13) 向离心管的底部加满室温的 70% 的乙醇。此步可将剩余的氯化铯浸出，而 RNA 将会在两分钟之后变成白色，并且会更紧密的附着在管壁上。
14) 倒掉或吸出剩余的液体，然后对 RNA 沉淀进行短时的干燥。当 RNA 开始变得透明时，向每个离心管中加入 175ul 含 0.1%SDS 的 TE 溶液，用移液器上下反复吹打，以悬浮和溶解 RNA。此过程应持续 1mim。之后，将 RNA 转移到一个新的无 RNase 污染的带有螺旋盖的离心管中，并向原离心管中再加入 25ul 含 0.1%SDS 的 TE 溶液，吹打几次。最后将两部分 RNA 溶液合并。如 RNA 仍没有完全溶解有时有一些小块残留），可将其冻在液氮中然后在 50℃ 水浴中解冻，反复一到两次，可使 RNA 完全溶解。
15) 对于 200ul 的 RNA 溶液，加入 150ulTE,30ul3nol/L 乙酸钠 (pH5.2) 和 900UL乙醇，以沉淀 RNA. 于-2O℃3Omin.4℃ 离心 lOmin。弃上清，用 70% 乙醇冲洗沉淀，干燥，用少量的水溶解 RNA(—般大约 80ul，具体依 RNA 量的多少而定）。
16) 将 RNA 储存在-80℃
注意事项
用此方法提取线虫 RNA 所得的 RNA 的产量为：每毫升被压紧的虫体可以收获 0.8〜l.lmg 纯的总 RNA. 产物中可能包含一些起始原料物质中所含有的 K.coliRNA 的污染。E.coliRNA 在制备物中的比例可以通过凝胶电泳、杂交等方法确定。线虫 rRNA 的位置在 3.5kb〜1.7kb, 这样就能与电泳位置在3.Okb〜1.5kb 的 E.colirRNA 区别开来。如果线虫用液体方法培养，则最终所得制备产物中 E.RNA 的含量将会为 0〜40%
来源：丁香实验
