外泌体分离：超速离心法 PK 试剂盒法，谁赢了？

和元生物2022-05-31

1019

外泌体（Exosomes）是大小为 30-150 nm、呈茶托状的细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs），广泛存在于细胞培养上清及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。

几乎所有细胞都可以分泌外泌体，但是外泌体来源不同，其内部装载的 RNA、蛋白质、脂类等重要物质在数量和丰度上有很大差异。

外泌体可通过传递信息影响目标细胞的功能，激活细胞信号通路，在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。外泌体可以作为临床诊断中的生物标志物或疾病治疗的靶点，同时也可以作为药物载体，参与神经疾病和癌症等多种疾病的病理过程。

外泌体的分离纯度对外泌体的功能研究非常重要，但是外泌体的分离一直是困扰外泌体研究人员的一个难题。虽然分离外泌体方法有很多种，包括差速超速离心法（超离法）、超滤法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、试剂盒法等。

但目前文献中常用的分离外泌体的方法主要是超离法和试剂盒法，那这两种方法研究人员该如何选择呢？为了解决大家的疑惑，我们专门做了对比实验进行阐述。

（一）实验分组和开展实验确定：

此实验共分为 3 组，每组设置 2 个重复，所选原始样本是 293T 细胞培养上清。

组1：超离法分离（UC-1，UC-2）；

组2：使用某国外试剂盒 SXX（SXX-1，SXX-2）；

组3：使用某国内试剂盒 UXX（UXX-1，UXX-2）。

开展的实验包括外泌体分离、透射电镜（TEM）、纳米颗粒检测（NTA）、BCA、WB。

（二）实验结果如下：

外泌体分离方法：此处步骤比较长，内容篇幅有限，暂且省略步骤，如有需要，可在微信公众号下面留言。

透射电镜拍摄：先制片，再拍摄。制片是先将外泌体固定在铜网上，再用 2% 醋酸双氧铀染色液染色，随后放于灯下烤 10 min，再拍照。

从上面的图片中可以看出，超离法相比较两种试剂盒的分离效果，纯度较高，电镜图片更清晰。

纳米颗粒大小检测：将外泌体样本进行稀释并检测，仪器自动出分析报告。

从上图结果可以看出，超离法和试剂盒法得到的外泌体大小差不多，基本在 110-120 nm，颗粒数浓度也相似，在 undefined10 的 10 次方 particles/ml 左右。

BCA 蛋白浓度测定结果：将外泌体样本进行 BCA 蛋白浓度测定，结果如下表。

WB 检测标志物：根据上述的 BCA 定量结果，制备样本，上样，做 WB。

超离法由于 BCA 测定的浓度数值低，用了最大上样量 25 ul，试剂盒法用的体积少一些，换算后每孔的蛋白总量如下：

选用外泌体标志物 CD9 和 TSG101 作为本次的检测指标，实验结果如下：

1、在 CD9 指标检测中，超离法的两个样本 UC-1 和 UC-2 尽管每孔只用了 4.5ug 的总蛋白，但是两孔中都能明显看到 CD9 的蛋白条带，而试剂盒样本 SXX-1、SXX-2、UXX-1 和UXX-2 每孔用了 25ug 蛋白，但是仍旧没有看到条带出现。

2、在 TSG101 指标检测中，上样量和 CD9 的一样，超离法和试剂盒法共 6 个孔都出现了条带，但是超离法的 UC-1 和 UC-2 条带亮度比较显著。

综合上述 BCA 数据和 WB 结果可知，虽然超离法得到的外泌体蛋白浓度较低，但是其纯度较高，基本就是真正的外泌体蛋白；而试剂盒法中虽然从 BCA 的数据来看蛋白浓度较高，但是 WB 结果说明了它的蛋白浓度并非真正的外泌体蛋白，含有很多杂质蛋白。

（三）实验结论分享

通过本次对超离法和试剂盒法效果的比较，可以发现，超离法经过多次离心步骤，可以获得纯度较高的外泌体，但是也会有一定的外泌体损失。试剂盒法虽然得到较多的外泌体，但是也有很多杂质混在一起。每种方法都有利弊，可以根据自己的需求选择合适的方法。

建议：如果做外泌体示踪、细胞功能学或动物实验，尽量选择用超离法做，一方面这类实验外泌体需求量比较大，超离法的通量较大，比较适合；另一方面这些实验对外泌体的纯度要求比较高，超离法的杂质去除相对比较干净，不至于让别人怀疑实验的其他可能性。