超速离心法提纯包装的 H S V 扩增子

超速离心法提纯包装的 H S V 扩增子

材料

试剂

干 冰
含钙离子和镁离子的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（D P B S )，无菌
乙 醇（7 0 % V /V )

溶于含钙离子和镁离子的 D P B S 蔗 糖 溶 液（3 0 % V /V )，过滤除菌

仪器

Bioguard 生物安全柜（Baker Steriguard I I 或同类产品）

离 心 管（锥形， 15m l 和 50m l ，无菌； C o r ning 或同类产品）

医用台式离心机（I E C G P 8R Centra 或同类产品）

C u p 超 声 仪（Misonix X L 2010 或同类产品）

镊子

冰箱：超 低 温（一 80°C )

乳胶检查手套（无粉）

微型离心机（ I E C M i c r o m a x 或同类产品）

微量离心管（0. 5m l 和 I.7m l , 无菌； A x y g e n 或同类产品）

微型涡旋振荡器（V W R 或同类产品）

P A 离 心 管（36m l 容量， Sovall 03141 或同类产品）

电动移液器（D r u m m o n d 或同类产品）

移液器和无菌吸头（可调体积；Rainin P -20、 P -200 和 P -1000 或同类产品)

超速离心机（Sorvall Discovery I O O S 或同类产品）

水 平 转 子（Sorvall 630/17 Surespin 或同类产品）

离 心 桶（预冷， Sorvall 79338 或同类产品）

Q 吸 头（无菌）

一次性移液管（5m l 、 I O m l 和 25m l 容量，无菌）

水浴锅，（3 7 ± 1 )°C ( V W R 1235 或同类产品）

方法

1•预冷超速离心桶（在冰箱里）和 转 子（在超速离心机里）。

2 . 用 7 0 % 乙醇清洗 36m l 的超速离心管两次。用无菌的 Q -tip 清除所有剩余乙醇，倒置放在生物安全橱中空气干燥。

3.在 37°C 中水浴解冻以前得到的病毒（从方案 4 的步骤 2 1 中）。放置在冰上。

4.使用杯形超声仪（在冰上预冷）在 第 8 个设置超声处理每个样品 3 次，开 30s 后关闭 30s。

每次超声两个解冻的样品，经常加人新鲜的冰。

5.1290g离心病毒 lOmin。

6.加 人 5〜7m l 含钙离子和镁离子的冷 D P B S 到超速离心管。

7.再加人 7〜I O m l 冷的、无菌的溶于 D P B S 的 3 0 % 蔗糖到每个管中。

8.转移病毒上清（步骤 5 ) 到一干净的 5m l 锥形管，再次 1290 足离心 l Omin。

9.第二次离心后， 一 滴一滴地加人澄清的病毒上清到蔗糖梯度超速离心管中。

10.加入充分的含钙离子/镁离子冷的 D P B S 到每管中直至离顶部〇 • 25c m 。

11.使 用 7 0 % 乙醇除菌的镊子将管子放在预冷的桶趾。小心地换下并固定桶的盖子。

12.4°C 在超速离心机中 78 O O O g 梯度离心 l h。

13.从每个超速离心管中倒出上清，用无菌的 Q 吸头清除残余的蔗糖。
病毒出现在管的底部，略带黄色的沉淀。

14.在收取过程中，在每个 T -150 瓶里加入 IOOfJ 含钙离子和镁离子的 P B S 。置冰上不超 过 30m i n 用来软化沉淀。

15.小心吹打使沉淀重新悬浮，并使沉淀团块打散。小心不要产生气泡。

16.转移悬液到 1.7m l 无菌的微量离心管中。瞬 时 离 心 （小 于 3s)，使所有不能悬浮的蛋白质碎片沉淀。

17•分装 25〜IOOul 病毒悬液到已标记、预冷的、无菌的〇.5m l 微量离心管中。立即放在干冰上冰冻。放在标记的冰盒或冰袋中一 80°C 储存。