质 粒 D N A 的制备

质 粒 D N A 的制备

材料

试剂

琼 脂 糖（电泳级； Invitrogen 或相当的产品）

抗生素

氨节青霉素（100ug/ m l , Sig m a-Aldrich 公司或相当的产品）

卡那 霉 素（lO^g/m l , S i g m a-Aldrich公司或相当的产品）

转化有目的质粒 D N A 的 E• coli甘油保藏菌种

内切核酸酶（N e w England Biolabs 或相当的产品）

无水乙醇

L B 肉 汤（E M D C h e m i c a l s 或相当的产品）

质粒纯化试剂盒：质粒大提制备试剂盒（Bio-Rad 732-6130)

氯化钠溶液（5m o l /L )

T B 肉 汤（250m l ; Invitrogen或相当的产品）

双 蒸 水（d d H 20)

仪器

离 心 机（Sorvall R C 5B 或相当的产品）带有 SLC-1500 的 转 头（ Sorvall 或相当的产品)

粗纱布

临床用离心机（I E C G P 8R C e n t r a 或相当的产品）

离 心 管（50m l ; C o m i n g 或相当的产品）

温 控 摇 床（L a b - L i n e 或相当的产品）

电泳胶盒（O w l 或相当的产品）

E r l e n m e y e r 锥 形 瓶（2L 体积）

乳胶检查手套（无粉）

微型离心管（I.7m l A x y g e n 或相当的产品）

Oakridge 瓶（36m l 和 250m l ; Thermo-Electron 或相当的产品
）
移 液 器 架（D r u m m o n d 或相当的产品）

移 液 枪（可调容量；Rainin P -20、 P -200、 P -I O O O 或相当的产品）

一次性移液管（5m l 和 10m l , K i m b l e 或相当的产品）

分光光度计（B e c k m a n D U 8 0 0 或相当的 产 品）

带 帽 试 管（l3m m X 100m m ; V W R 或相当的产品）

方法

1•将加有抗生素的 3 m l 无 菌 L B 培养基置于 13m m X IO O m m 的带帽试管里，把包含有目的质粒的£•Coli菌种接种于其中， 37°C 下摇床孵育 8 h 。

2.将步骤 1 中培养的 3m l £•coli 加 人 250m l 含有抗生素的无菌 T B 培养基中，置 于 2L的锥形瓶中在 37°C 下振荡培养过夜（16〜20 h )。

3•在 250m l 离 心 瓶 中 置 人 250m l 培养液，在 Sorvall R C 5B 离 心 机 中 以 3795 g 离心I O m i n 获得细胞，弃上清。

分离质粒 DNA

此方案利用的是 BioRad Quantum Plasmid Maxiprep Kit 试剂盒，有如下修改过的步骤。

4 . 用 15m l 重悬液重悬细菌菌粒。

5•加人 23m l 裂解缓冲液，轻轻混勻。室 温（约 22°C ) 下静置 4m i n 。

6•加入 15m l 的中和缓冲液，轻轻混匀，室温下静置 3m i n 。
白色的絮状物将会变清。

7.4°C 下 Sorvall S L C -1500 转头以 16 736 g 离心 20m i n 。

8•将上清从一粗纱布滤人 50m l 离心管以除去细胞碎片。

9.把步骤 8 中滤过的上清液等分置人两个 50m l 离心管中，每管加人 5m l 试剂盒里的Q u a n t u m Matrix。颠转 10 次混匀。

10.临床用离心机室温 1290 g 离 心 5m i n 。

11.从两管中移出上清液，用 12.5m l 清洗液重悬沉淀并合并在一个 50m l 离心管内。

12•临床用离心机室温 1290 g 离 心 5m i n ，弃上清，用 15m l 清洗液重悬沉淀。

13•将试剂盒中的一个离心柱放入 50m l 离心管中，将悬浮液加人离心柱中。

14.临床用离心机室温 1290 g 离心 5m i n , 弃上清。

15.移去离心柱并注人滤出液。

16•加 I O m l 的洗液到离心柱中，临床用离心机室温 I290 g 离 心 5m i n 。

17.将离心柱转入一个干净的 50m l 离 心 管（试剂盒中的），加 入 5m l 双蒸水。临床用离心机室温 1398 g 离 心 5m i n 。

18.加人 2 倍体积的预冷 （一 20°C ) 的乙醇，并在每毫升滤出液加入 5mol/L N a C l 溶液6 〇 M l，最终达到 1 倍滤出液的体积，将它们加入 36m l 的 Oakridge 管中。

19.S o r v a l l R C5B 转头 4°C ， 20 846 g 离心 30m i n 。
放管子的时候注意其方向。

20•小心的移出上清液，并倒置管子，让质粒 D N A 沉淀在空气中室温下干燥 l O m i n 。

21•向管内加人 500ul 双蒸水，盖上盖子将沉淀面向下在水平摇床上振荡过夜。

22.S orvaIl R C 5B 转 头 4°C ， 3619 g 离 心 5m i n ，把质粒 D N A 重悬液转入 I.7m l 离心管。

23.紫外分光光度计测得 A 2S0/A 28。，计算 D N A 的浓度。

24.用合适的限制性内切核酸酶消化 2 吨质粒 D N A ， 1 % 琼脂糖胶分析限制内切核酸酶图谱。