制备无辅助病毒的 H SV -I 扩增的包装

制备无辅助病毒的 H SV -I 扩增的包装

材料

B H K -21 细 胞（A T C C : C C L -10)

这些细胞如方案 3 中 步 骤 13 所述种板，在做包装实验前至少培养了 3d , 细 胞 达 到 8 0 % 〜1 0 0 % 的汇合度，传 代 B H K 细胞并以 T -150 瓶所需的一半细胞数目种板准备包装实验。体外处理后细胞传代数应该小于 30。

脱 色 液（10% V/V )

D M E M 培养液，无菌、高糖、添 加 L -谷氨酸、无 S -丙 酮 酸（Invitrogen 或相当的产品）Dulbecco 磷酸盐缓冲液（D P B S )、无菌、无 C a2+/ M g 2+

乙 醇（7 0 % V /V 和 100%)

无 菌 1 0 % 胎 牛 血 清（F B S )，通过支原体测试1 0 % 青霉素/链 霉 素（10 000I U /m l ; Invitrogen 或相当的产品）

环己二乙酰胺（H M B A ; O.5mol/L , 过滤除菌）（S i g m a -Aldridi)

蒸 溜 水（d H 20 ) ，灭菌

转染试剂 Lipofectamine (Invitrogen 18324-012)

Opti-MEM (Invitrogen 31985-070)

质粒

扩增质粒 D N A (根据方案 1 制备）

P B A C -V 2 D N A (或相当的产品，根据方案 2 制备）

p B S K S (vhs) 质粒 D N A (根据方案 1 制备）

P L U S 试 剂（Invitrogen 11514-015)

氯 化 钠（5mol/L)

仪器

无辅助病毒 H S V -I 扩增包装的设备要求同方案 3 —样 ，有以下其他仪器：

细胞刮

7 JC 浴式 C O 2 孵 箱 [(34±1.0)°C , 5 % C 0 2; F o r m a 或相当的产品]

方法

1.在生物安全柜无菌操作，每 个 T -150 瓶 接 种 I.5 X 10⁷ 个 B H K -21 细胞。 37° C 孵育过夜。

2•用乙醇沉淀扩增质粒和 p B S K S (vhs) 质 粒 D N A 。

3.在每个微离心管内，加 人 足 量 的（以 4 计）扩增载体质粒和 p B S K S (v h s) 质粒D N A 以 达 到 每 瓶 每 种 质 粒 产 生 用 来 包 装 病 毒 。加人无菌水使之终体积为每管 1 〇〇ul

4.对 每 100ul稀 释 的 D N A 』加 人 6ul 5m o l / L N a C l 和 2 0 0 ul的无水乙醇混合均匀，—20°C 冰冷至少 30m i n 或过夜。

5.4°C , 10 000 发离心 20m i n 以沉淀 D N A 。

6•在生物安全柜内将管内乙醇吸出，用 1.7ml 的 7 〇 % 乙 醇 漂 洗 DNA沉淀。

7•在生物安全柜内吸出乙醇并将管子倒置干燥沉淀 l 〇 m in (不要过干)。

8• 用 50m l 无菌水重悬沉淀， 4°C 冷藏过夜。

如果样品在无水乙醇中冷冻过夜（步 骤 4 ) , 可略去过夜冷藏。当乙醇沉淀后立即进行下面步 骤（步 骤 5〜8)。

9.在生物安全柜将转染试剂混合物准备好。

为每个瓶中的 H S V -I 扩增的包装准备一批转染试剂混合物。

a•在一 15m l 试管中，加人 3m l 的 O p t i - M E M (温至 37℃、 25ug p B A C-V 2 D N A 、7 ug 扩增质粒 D N A 、 7ug p B S K S (vhs) D N A ， 混合均勻。

b. 向管中 Iml Opti-M E M 加 入 71ul 的 P L U S 试剂。

如果在加入 P L U S 试剂时候有沉淀，丢弃掉并重复上述步骤。

c. 向另一个 15m l 试管中加入 2m l Opti-M E M 。

d•向第二个管中加人 107plLipofectamine。

e•室温下将两支管子温育 20m i n 。

f•非常缓慢地将第一管和第二管内容物混合（超 过 30s)。让Lipofection 混合物在室温下静置 20m i n 。

如果在混合的时候发现有 D N A 沉淀，弃去并重复步骤 9。

10.在温育转染液混合物的时候，移 去 B H K 包装细胞的培养液，每个培养瓶中加入12m l 的 Opti-M E M 。

11.用一个 I O m l 的枪把转染混合液加人到 T -150 瓶中的细胞里，轻轻混匀，在 37℃下孵 育 5 h 。

12.加 16m l 含 有 2 0% F B S 的 D M E M 和 2m m o l /L 的 H M B A 至每个瓶中， 34°C 温育过夜。

13•在生物安全柜里将每个瓶中培养液移去，用 25m l 的 含 有 1 0% F B S 的 D M E M 和2m m o l / L 的 H M B A 继续培养。

14 34°C 温育培养瓶 2〜3d 。

15.在生物安全柜里移去每瓶的细胞培养液。

16.把细胞刮进 I O m l 冷的无 C a2+/M g 2+ 的 D P B S 中，将每个瓶中刮下的细胞收集在一个 50m l 管子中，置冰上。

1 7•用 I O m l 冷的无 C a 2+ /M g 2+ 的 D P B S 冲洗瓶中残留的细胞，一 直将管子置于冰上。

18.250 g 离心管子 l O m i n。

19.把 D P B S 倒人一个烧杯中，其中有 1 0 % 的脱色液使释放出的病毒失活。

20•在 1.5m l 瓶中加入无 C a 2V M g 2+的 D P B S 重 悬 沉 淀（沉淀中有细胞固定的扩增病毒颗粒)，轻轻吹打均勻。

21.在扩增颗粒纯化前应于一 80°C 冰冻重悬的沉淀至少 Ih (见方案 5)。