简介
差速离心法是以从低到高不同的转速离心，使较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高的转速将原来悬浮在上清液中的小颗粒物质沉淀下来，从而达到逐级分离胞（细胞器）的目的。
原理
差速离心法分离细胞和细胞器的基本原理是各种不同的细胞和细胞内的各种细胞器的大小、密度不同，在同一离心场内的沉降速度也不同。根据这一原理，可用差速离心法、密度梯度离心法或密度梯度平衡离心法来分离细胞及细胞器。其中差速离心法是以从低到高不同的转速离心，使较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高的转速将原来悬浮在上清液中的小颗粒物质沉淀下来，从而达到逐级分离胞（细胞器）的目的。
材料与仪器
器材：
玻璃匀浆器、低温离心机、天平、显微镜、相差显微镜、离心管（Eppen-dorf 管）、载玻片、10 ml 滴管、冰盒、冰块、尼龙布、染缸、20 ml 烧杯、大白鼠。
试剂：
① 生理盐水
② 0.25 mol/L 的蔗糖溶液
③ 0.34 mol/L 的蔗糖溶液
④ 51 g/L 的蔗糖溶液
⑤ 51.5 g/L 的蔗糖溶液
⑥ 95％ 乙醇
⑦ 甲基绿-派若宁染液
⑧ 纯丙酮
⑨ 0.2％ 的詹纳斯绿 B
步骤
差速离心法分离细胞和细胞器的基本过程可分为如下几步：
（一）组织匀浆制备
A 取材 将空腹 12 h 的大鼠拉颈处死。剖开腹部，迅速取出肝脏，用生理盐水洗净血污，滤纸吸干。
B 制备匀浆 称取约 2 g 左右的肝组织，用预冷的 0.25 mol/L 的蔗糖溶液冲洗数次，再剪碎。以预冷的 0.25 mol/L 的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织（9 ml/g），倒入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后，用双层尼龙布过滤，即制得肝细胞匀浆，备用。
（二）差速离心法分离细胞器
A 细胞核的分离 将制备好的肝匀浆移入离心管，沿管壁小心加入等量的 0.34 mol/L 的蔗糖溶液覆盖于上层，700 g 离心 10 min（最好在低温离心机中进行）。将上清液移入离心管内并置于冰浴中待用。沉淀用 0.25 mol/L 的蔗糖溶液洗涤悬浮后以 1000 g 离心 10 min，共 2 次。
B 质膜的提取 吸取上述细胞核沉淀中较疏散的上层，悬于密度为 51 g/L 的蔗糖溶液，移入离心管，沿管壁注入密度为 51.5 g/L 的蔗糖溶液覆盖于液面上，低温离心机中 700 g 离心 10 min，于两层溶液的界面处吸取质膜成分。
C 线粒体的分离 将分离细胞核时收集的上清液低温下 3300 g 离心 10 min，将上清液移入离心管内并置于冰浴中待用。沉淀用 0.25mol/L 的蔗糖溶液悬浮后，在低温离心机中以 3300 g 离心 10 min，共 2 次。取沉淀。
D 溶酶体的分离将分离线粒体时收集的上清在低温离心机中以 16300 g 离心 10 min，将上清液移人离心管内并置于冰浴中待用。沉淀用 0.25 mol/L 的蔗糖溶液悬浮后，16300 g 离心 20 min，共 2 次。取沉淀。
E 微粒体的分离 将分离溶酶体时收集的上清液在低温离心机中以 100000 g 离心 30 min，取沉淀。
差速离心形成的沉淀物的细胞器成分见表 8-1。
（三）分离细胞器的鉴定
A 细胞核的鉴定 分离后的细胞核涂片，空气干燥，浸入 95％ 的乙醇固定 5 min。浸入甲基绿-派若宁染液的染缸内 10～20 min，浸入纯丙酮 30 s 分色，蒸馏水漂洗数秒钟，空气干燥后镜检。细胞核 DNA 呈蓝绿色，核仁和混杂的胞质 RNA 呈红色。
B 线粒体的鉴定 线粒体涂片，0.2％ 的詹纳斯绿 B 染 20 min，相差显微镜观察，线粒体呈亮绿色。
C 溶酶体、微粒体和质膜可用酶学方法检测。哺乳动物细胞生物膜的主要酶学特点见表 8-2。
注意事项
细胞器的分离过程包括两个主要的阶段：破碎细胞和细胞成分的分离。组织匀浆时要尽量使细胞完全破碎。经差速离心后所得的沉淀中会存在“交叉污染”，如沉降慢的物质会由于抱载现象而随大量沉降快的物质一起沉降，通过洗涤沉淀物，可以解决这个问题。由于质膜碎片的大小不等，所以在各沉降速度下都有下沉，可能对各亚细胞器分离后的鉴定有所影响。
来源：丁香实验
