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用T4噬菌体多核苷酸激酶标记寡核苷酸探针

合成的寡核苷酸在合成时其5'端缺少一个磷酸基, 因而极易用T4 噬菌体多核苷酸化反应,这种探针可达到于 γ= 32 P从[ γ= 32 P]ATP本身同样高的放射比活度。下面所述的反应是为对10pmol寡核苷酸进行高比活度的标记而设计的。通过扩大或缩小这一反应的规模便可成功地标记不同量的寡核苷酸,而各成分的浓度则可保持不变。 1) 配制下列反应混合液: 寡核苷酸(10pmol/ μl) 1.0 μl 10xT 4 噬菌体多核苷酸酶缓冲液 2.0 μl [ γ= 32 P]ATP(比活度5000Ci/mmol;10mCi/ml水溶液)(10pmol) 5.0 μl水 11.4 μl 10xT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.6) 0.1mol/L MgCl2 50mol/L 二硫苏糖醇(DTT) 1mol/L 盐酸亚清胺 1mol/L EDTA(pH8.0)充分混匀,在一装有10 μl 10mol/L Tris.Cl(pH8.0)的反应管内加入0.5 μl上述反应混合液,搁置一旁留备步骤3)中使用。该反应所含[ γ

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外源DNA片段未的性质

1.带有非互补突出端的片段   用两种不同的限制酶进行消化可以产生带有非互补突出端的片段,刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多数质粒载体均带有由几个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点。由于现有的多克隆位点如此多样,因而几乎总是能找到一种带有与外DNA片段未匹配的限制切位点的载体。于是,采用所谓的定向克隆即可将外源DNA片段插入到载体当中。例如:载体pUC19用BamHl和Hind-Ⅲ进行消化,然后,通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段,以使同芤下来的多克隆位点 缺小片段分开。于是,这一载体就可以同有与BamHl和HindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源DNA区段相连接。用得到的环状重级体化大肠杆菌,检查氨苄青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互补,载体片段不能有效地环化,所以转化大肠杆菌的效率也极低。因此,大多数具有氨苄表霉素抗性的细菌都含有带外源DNA区段的质业,外源DNA区段成为连接HindⅢ和BamHI位点的桥梁。当然,可以根据特定的外源DNA区段来改变限制酶的组合方式。   如要制备定向克隆载体,它尽量避免使用大多克隆位点上彼此直接相邻的限制

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质粒载体和外源DNA中限制酶切位点的性质

 如今,质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多,因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源DNA片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可比拟的优点,也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源DNA。另一种方案,则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如,识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段,这样用BglⅡ消化而制备的外源DNA片段可以克隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源DNA或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下,用切点位于多克隆序列侧翼的限制酶进行消化,可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源DNA两端的限制酶切位点之间,不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决: 1)在线状质粒末端和(或)外源DNA片段的末端接上合成在接头或衔接头。 2)在得到控制的反应条件下,用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平带3'凹端的DNA片段。如第九章所讨论,这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端,从而促进载体和外源DNA的连接。因为部分补平反

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转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的RNA染色

当RNA自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前,溴化乙锭的染色时间一般不宜过长,这是因为被染料饱和的核酸分子,其转移效率有所降低。然而,用溴化乙锭作短暂染色,既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用,又独具同时检测凝胶和凝膜上的RNA的优点。 1.方法I 1)电泳结束后,含乙二醛-DMSO的凝胶应浸入含溴化乙锭(0.5 μg/ml)的10mmol/L磷酸钠(pH7.0)溶液。甲醛凝胶需用无RNA酶的水淋洗,用20xSSC溶液浸泡,随后用含溴化乙锭(0.5μg/ml)的20xSSC溶液染色。 2)于室温染色5-10分钟,在紫外灯下观察,照像。 3)按前所述方法, 将凝胶中的RNA转移至硝酸纤维素滤膜,转移后能常在学光下也可看出已染色的RNA条带。 这种方法仅适用于每一泳道均含有相当大量(如5μg 以上)的RNA的情况。 2.方法Ⅱ   硝酸纤维素滤膜上的RNA也可以用下述方法染色:从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条带进行染色,也可以用经过杂交并经X光片曝光后的整张滤膜进行染色(A.Efstratiadis,未了表材料)。 1)

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携带多个目的基因的重组腺病毒的制备

1 、目的基因的获取: ( 1 )特定细胞表达的目的基因:提取 RNA 后进行反转录, PCR 扩增; ( 2 )载体中含有的目的基因:酶切或 PCR 获取; ( 3 )融合蛋白基因:根据需求,进行 PCR 合成目的基因; 2 、穿梭质粒的构建: ( 1 )携带目的基因的穿梭质粒的构建:通过酶切、连接的方式得到,一般采用的是 pShuttle-cmv 载体; ( 2 )携带多个目的基因的穿梭质粒的构建:如同时表达两个目的基因,可通过 IRES 将两个目的基因相连; ( 3 )携带干涉序列 shRNA 的穿梭质粒:首先将 H1 启动子构建到 pShuttle 质粒上,然后将目的基因克隆到 H1 启动子下游; 3 、重组腺病毒质粒构建: 携带目的基因的穿梭质粒线性化后与 Adeasy-1 共转 BJ5183 感受态细胞(电转),筛选得到重组腺病毒质粒,并经 PacI 酶切鉴定:可见目的质粒出现两条条带,分别为 3.0kb 或 4.5kb 和 >23Kb 两条条带。 将得到的重组腺病毒质粒转染 DH5 a 感受态细胞,以便于

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无毒核酸电泳染料SUPER Green I使用方法

SUPER Green Ⅰ(10,000× DMSO溶液,电泳级) SUPER Green Ⅰ核酸染料特点 ● 无毒性:属花箐类染料,容易生物降解,无致癌毒性。 ● 灵敏度高:至少可检出20pg DNA,高于EB染色法25~100倍。 ● 信噪比高:样品荧光信号强,背景信号低。 ● 操作简单:无须脱色或冲洗,即可直接用紫外凝胶透射仪或可见光透射仪观察。 ● 适用范围广:可适用于多种凝胶电泳方法:琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉 冲电场凝胶电泳和毛细管电泳等。 ● 使用方便:对分子生物学中常用的酶(如:Taq 酶、反转录酶、内切酶、T4连接酶 等)没有抑制作用。 ● 经济:价格比银染便宜。 SUPER Green Ⅰ使用方法简介 1.胶染法(用法同EB) (推荐方法,见图1) (1) 制胶时加入SUPER Green I 核酸染料。冷却胶至50℃左右,每100mL胶中加入3~5μL SUPER Green I 核酸染料。 (2) 按照常规方法进行电泳即可。 u

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腺病毒RNAi干扰

(1)原理 腺病毒(adenovirus,AV)是一种没有包膜的线状双链DNA,它能感染分裂细胞和非分裂细胞,在核内以神经元细胞的形式复制,存在多种AV血清型。到目前为止,构建的绝大多数载体都是基于血清型2和5,通过转基因的方法取代E1或E3基因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在表达高水平E1和E3基因的细胞中复制,因此适合应用于治疗的高效控制系统。腺病毒载体能够高效传递和表达基因的能力(尤其是在体外),由于具有宿主范围广,对人致病性低;在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因;能有效进行增殖,滴度高;与人类基因同源;不整合到染色体中,无插入致突变性。对于难转染的细胞,如原代或非分裂细胞,采用病毒递送miRNA/shRNA的方式是非常有效的选择。 (2)服务流程 1)构建表达miRNA/shRNA的腺病毒载体,采用PacI消化纯化质粒使ITRs裸露出来。 2)将腺病毒表达克隆转染293A细胞。收获细胞以制备病毒粗提液。 3)将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。确定病毒滴度。 4)将病毒上清加入靶细胞中 5)分析miRNA/shRNA的表达和相应的Knockdonw结

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基于inkjet技术的微球制备方法

美国MicroFab公司,成立于1984年,一直致力于喷墨打印技术在工业领域的应用和发展。至今MicroFab的产品和技术已经涉及到非常广泛的生产和科研领域。每个领域都会有专业的应用工程师提供建议和解决方案,从制造业到研究机构,MicroFab都能为您提供精确微量点滴的产品和技术方案。包括有:  铅与无铅焊料的粘合剂;  光学和电子聚合物;  蛋白质及DNA等生物医学的药物使用等。 MicroFab的Jetlab系列设备是专为实验室研究微量点滴、微量喷射以及微流体所设计的。它为喷墨打印技术在工业以及科研领域的应用提供了一种可观察和优化的工具。包括:  软件控制运动平台XY方向定位;Z轴控制打印头高度;  Print-on-the-Fly两轴同步打印或点对点打印;栅格与矢量打印模式,可以进行复杂程序的打印;  CCD相机用于液滴观测或衬底观测;  底板固定,气动隔振;光工作区;架空HEPA过滤器;溶剂排出口;  气压和温度控制;  JetDrive III双极和任意波形模式、单一和突发模式驱动电子单元。 Microfab最新推出了Jetlab®4系列以满足广大客户对

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酵母双杂交筛选

第二章 酵母双杂交筛选 1. 操作流程 诱饵基因转化筛库宿主菌Y190――>含诱饵基因的Y190 保种――>诱饵基因的 自激活检测――>筛库(组织库或者小文库)――>挑选鉴定阳性克隆――>抽提阳 性克隆中PREY 质粒并在细菌中扩增――>猎物(Prey)质粒与诱饵(Bait)质粒共 同转化Y190,验证其相互作用 2. 方 法 2. 1 诱饵基因转化筛库宿主菌Y190 1) 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜), OD600 达到1.2 左右。 2) 将此3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD 中培养4 小时左右,使 培养液OD600 达到0.6。 3) 50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD),Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g (1, 865rpm),5 分钟离心收集菌体,弃上清。 4) 20ml ddH2O 重悬菌体,Eppendorf Centrifuge 5810R,700g,5 分钟离心收 集菌体,弃上清。 5)

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美国科学家发现一种用处极大的细菌

美国科学家发现一种用处极大的细菌  美国马萨诸塞州大学科学家 2003 年 12 月 17 日宣布,他们发现一种存在于泥土中的细菌能够帮助清理含放射性元素的废料,而且还可能用来发电,制成生物电池。  科研人员发表在《科学》杂志上的文章说,这种具有异常功能的细菌名为减硫性土壤类细菌。通过破译与分析细菌的基因组,研究人员发现,这种细菌内的基因可使它们将很多不同的金属和放射性元素从地下水中沉淀出来,并将放射性元素转化成便于分离的固体。这些放射性元素包括铀、锝和铬等。科学家认为,该细菌这一功能可以用来清除核废料与清洁环境,防止上述放射性元素流入水井或河流污染饮用水源和自然环境。与此同时,美国能源部的科学家说,这种细菌还可以控制金属的电子运动,因此可作为生物电池的构成部分,用来发展生物能源。  科研人员初步解释了这种细菌功能的作用机理。他们认为,这种细菌内有约 100 个基因,似乎可以产生某种类型的蛋白质,协助把金属中的电子“移来移去”,

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染色体结构显示和检测

染色体结构显示和检测 1) 染色体显带 显 Q 带法 1. 漂洗:取经过干热预处理或已老化的染色体标本,置于 pH6.0 缓冲液中浸 5~10 分钟。 2. 染色:浸入 pH6.0 的 GM 或 QD 染液中 5~10 分钟。 3. 漂洗:浸入新鲜 pH6.0 缓冲液中漂洗两次,每次 5 分钟。 4. 观察:向标本染色体面滴 1~2 滴新鲜缓冲液,覆以盖片(避免出气泡),置荧光显微镜下观察。 显 G 带法 胰酶 -Giemsa 混合显带法 1. 预处理:取中期染色体标本,置 60 ℃~ 60 ℃温箱中 20 ~ 30 分钟,或在 37 ℃温箱过夜,然后浸入 0.025M 磷酸缓冲液中, pH6.8 , 56 ℃温浴 10 分钟。 2. 消化和染色:用现配制的胰蛋白酶 -Giemsa 混合液消化和染色 10 ~ 30 分钟,混合液按如下比例配制: 0.025 M 磷酸缓冲

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DNA(基因)检测-Southern Blot

DNA (基因)检测- Southern Blot DNA 吸印转移 1. 室温下将电泳后的琼脂糖凝胶浸入 500ml 溶液 A 中,摇动 30 分钟后换 500ml 新鲜溶液 A 再摇 30 分钟,使 DNA 双链碱变性。 溶液 A : 5M NaCl 300.0ml 10M NaOH 50.0ml H2 O 650.0ml 2 .为使凝胶重新回到中性,换入溶液 B 中重复上述 1 过程。 溶液 B : 10M 乙酸铵 200.0ml 10M NaOH 4.0ml H2 O 1796.1ml 硝酸纤维素薄膜( NC 膜) 3 .料盒或盘中放一玻璃板支架,倒入 10 × SSC ,将 Whatman 3MM 滤纸放在玻璃板上,两头浸在液体中,用玻棒赶除气泡。 4.

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蛋白质检测-Western Blot

蛋白质检测- Western Blot 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1) 转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜铺在凝胶上,用 5ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2) 在凝胶 / 滤膜外再包一张 3mm 滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹在中间,保持湿润和没有气泡。 3) 将此滤纸 / 凝胶 / 薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中,凝胶面向阴极。 4) 将上述装置放入缓冲液槽中,并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5) 按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6) 转移结束后,取出薄膜和凝胶,弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量标准显现时取出,记录下标准位置。 3. 用 100ml 水洗涤纤维素膜,必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于 37 ℃保温 1 小时。 5. 室温下,用 PBS-Tween 缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中,尽

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酵母遗传学方法1:DNA分离

酵母 DNA 分离 1 )酵母 DNA 微量制备( 40ml ) 1. 在 125ml 三角瓶中用 40ml YPD 培养液在 30 ℃条件下培养细胞达最大生长量(过夜)。 2. 将上述培养物移入螺盖离心管,用医用离心机或 Sorvall SS - 34 转头以 5000r/min 离心 5 分钟,弃去上清液。 3. 将细胞悬浮在 3ml 的 0.9mol/L 山梨醇- 0.1mol/L Na2 EDTA(pH7.5) 溶液中。 4. 加 0.1ml 的 2.5mg/ml 消解酶 100T ,置 37 ℃条件保温 1 小时。 5. 用医用离心机或 Sorvall SS - 34 转头以 5000r/min 离心 5 分钟,弃去上清液。 6. 将细胞重新悬浮在 5ml 的 50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L 醋酸钠溶液中。 7. 加 0.5ml 的 10 %十二烷基硫酸钠( SDS ),混匀。 8. 置 65 ℃保温 30 分钟。

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酵母遗传学方法2:蛋白质的抽提

酵母蛋白质的抽提 此法抽提的酵母蛋白适用于 SDS 凝胶电泳和 Western 印迹分析。 1. 从 OD600 = 2 的细胞培养物中抽提酵母蛋白质。培养物的一种简单制备方法是将细胞接种到 5ml YPD 中,过夜培养后获得指数培养物( OD600 = 0.5 ~ 2.0 )。 2. 在水浴上把 OD600 = 2 的细胞培养物转到含有 2ml 的 50mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 、 10mmol/L 叠氮化钠溶液的 13mm 离心管中,用吊篮式医用离心机离心沉淀细胞。 3. 用 25 号针头吸出上清液,再用 30 μ l ESB 缓冲液悬浮细胞。 4. 快速转入微型离心管,在 100 ℃下保温 3 分钟,使蛋白酶失活之后,样品存放于- 20 ℃。 5. 加入 0.1g 的 0.2mm 的玻珠,或装入玻珠直至液体刚好浸没,剧烈振荡混合 2 分钟。 6. 加入 70 μ l ESB 缓冲液,稍加振荡,置 100 ℃保温 1 分钟。 ESB 缓冲液(可在 4 ℃贮存数天): 2 % SDS 80 mm

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酵母遗传学方法5:酵母β-半乳糖苷酶的测定

酵母 β -半乳糖苷酶的测定 1) 粗提取物测定 1. 在适当温度下(通常 30 ℃),用适当培养液将 5ml 细胞培养物培养到浓度为 1 × 107 ~ 2 × 107 细胞 /ml 。如果自主复制质粒的杂合基因表达,可使用一种适当培养基对存在质粒的菌株进行筛选。 2. 在冰上冷却细胞,离心收集。注意:以下步骤保持细胞在冰上。 3. 弃上清液,将细胞悬浮于 250 μ l 裂解缓冲液中,然后置- 20 ℃冻结,以备的第二天测定。以下步骤均在 1.5ml 离心管中进行。 裂解缓冲液: 100 mmol/L Tris-HCl (pH8) 1 mmol/L 二硫苏糖醇 20 % 甘油 4. 若细胞冻结,可在冰上将其冻结。加玻珠恰好到液面下,再加 12.5 μ l PMSF 母液。 5. 以高速振荡混合 6 次,每次 15 秒,间歇时放在冰上。 6. 加入 250 μ l 的裂解缓冲液,用 1000 μ l 移液器插到离心管底部抽打使其充分混

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酵母遗传学方法9:酵母免疫荧光

酵母免疫荧光 1 )细胞制备 1. 培养 5ml 酵母至对数生长早期( 106 ~ 107 细胞 /ml )。 2. 直接加 1/10 体积的甲醛到培养基里固定细胞(加入的甲醛终浓度为 3.7 %,标准母液是 37 %)。 3. 细胞在甲醛中培养至少 1 小时。 4. 离心收集细胞,用 0.1mol/L 磷酸钾( pH7.5 )洗一次。 5. 把细胞悬浮在 1ml 的 50mg/ml 消解酶 100T 或 50 单位 /ml 的溶细胞酶 [ 溶于含有 2ml/ml 6- 巯基乙醇的 0.1mol/L 的磷酸钾溶液中 ] 。 6. 置 30 ℃培养 30 分钟,用相差显微镜检查原生质的生成率。细胞应呈黑色或半透明灰色,亮细胞(折射体)属于没有充分被消化的。菌蜕属消化过夜。 7. 离心收集细胞,悬浮在 1ml 的 PBS 中。 2 )染色 1. 取 10ml 的 1mg/ml 聚赖氨酸,放到用特氟隆封闭的( Teflon

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细胞生长检测1:[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数

[3 H] 脱氧胸苷摄入法测定细胞数 1. 用 RPMI-1640 培养液洗涤对数生长期(培养 3 天)的 CTLL-2 细胞两次,每次 250 × g 离心 10 分钟,洗去培养液中残存的 IL-2 。 2. 用台盼蓝( 1 % Trypan blue )染色法计数细胞并决定细胞的活力,用 10 %小牛血清的 RPMI-1640 培养液悬浮细胞至 1 × 105 /ml 。 3. 在 96 孔细胞培养板中每孔加 0.1ml 倍比稀释的标准 IL-2 或待测样品,每个稀释度三个复孔,标准 IL-2 从 40 IU/ml 稀释到 0.019 IU/ml ( 8 ~ 10 个稀释度),阴性对照孔不加 IL-2 。 4. 每孔加 0.1ml 细胞悬液,在 37 ℃ 5 % CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 18 ~ 24 小时。每孔加 10 μ l ( 0.5 μ Ci 或 1.85 × 104Bq ) [3 H] 脱氧胸苷,继续培养 4 小时。 5. 用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上,

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细胞凋亡检测:流式细胞仪检测技术

细胞调亡的流式细胞仪检测技术 一、固定细胞的染色方法 1 ) PI 单染色法 方法一 1. 收集细胞( 1 ~ 5 )× 106 个, 500 ~ 1000r/min 离心 5min ,弃去培养液。 2. 3ml PBS 洗一次。 3. 离心去 PBS ,加入冰预冷的 70 %的乙醇固定, 4 ℃, 1h 。 4. 离心弃去固定液, 3ml PBS 重悬 5min 。 5. 400 目的筛网过滤 1 次, 500 ~ 1000r/min 离心 5min ,弃去 PBS 。 6. 用 1ml PI 染液, 4 ℃避光 30min 。 7. 流式细胞仪检测: PI 用氩离子激发荧光,激发光波波长为 488nm ,发射光波波长大于 630nm ,产生红色荧光,可分析前散射光对侧散射光的散点图及 PI 荧光的直方图。 方法二 1. 收集细胞( 1 × 106 个), 500 ~ 1000r/min 离心 5m

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细胞凋亡形态学检测与观察

hoechst33258染色,他们认为细胞发生凋亡时,染色质会固缩。 所以Hoechst染色时,细胞核会呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。 正常细胞核 刺激后有致密浓染的凋亡细胞 AO-EB染色法: The image below shows human lymphoma cells treated with the chemotherapy agent camptothecin. The cells that are undergoing apoptosis appear yellow and show the characteristic membrane blebbing (bubble formation)seen in cells dying via apoptosis. Promega公司的DeadEnd™比色法细胞凋亡检测系统能标记片断化的DNA,而这种片段化的DNA被视为是细胞凋亡的典型生化特征之一。DeadEnd™比色法细胞凋亡检测系统是一种在组织切片与培养细胞中标记凋亡细胞核的理想方法,与此同时,

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