自动凝血分析方法与技术的进展
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近年来,随着止血与血栓检测技术和手段日趋先进,使止血与血栓检测从传统的手工法发展为自动凝血仪测定,操作简便,结果愈加精密和准确。现就自动凝血分析方法与技术的进展作一简述。
1 概述
自动凝血分析是指通过自动凝血分析仪(automated coagulation analyzer)或其他分析仪对止血与血栓系统中相关成分进行分析并应用于出血、血栓性疾病的诊断、治疗及预后判断。回顾凝血分析的发展史,Duke于1910年首先用出血时间(BT)开创了凝血检测,随后Quick、 Proctor和Rapaport分别于1930年和1960年报道了经典的外源和内源性凝血系统的过筛试验凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(APTT)。1950年Schnitger和Cross率先推出可同时分析4个标本的自动凝血分析仪。进入70 年代,在临床化学、免疫学、生物技术的促进与推动下,自动凝血分析发展迅速。迄今为止,自动凝血分析仪已发展到第三代产品。第一代产品是单纯使用终点法的半自动单通道凝血分析仪,如CA100(Sysmex公司),第二代产品出现于80年代,是使用多通道和多种测定原理和方法的半自动凝血分析仪,如ACL-200(Coulter公司)等。第三代凝血仪的特征是全自动化,可迅速定量分析止血与血栓系统的多种成分和因子,如STA(Stago公司)等。自动凝血仪发展的另一趋势是床旁凝血仪的出现,尤其适用于床旁监测。
2 分析方法和原理
2.1 生物学方法(Biology)亦称凝固法 通过检测标本在凝固过程中电流的变化来判断凝固点终点。即将凝血因子激活剂加入待检血浆中,使血浆发生体外凝固,凝血仪连续记录凝血过程中一系列变化如光、电、机械运动等,并将这些变化信号转变成数据,用计算机收集、处理数据后得出检测结果。凝血仪使用的凝固法可分为3种:电流法(亦称钩方法)、粘度法(亦称磁珠法)和光学法(包括透射和散射比浊法) 。
2.2生物化学法( biochemistry) 这类方法主要是通过测定发色物质的吸光度变化,以推算待测物的含量。其基本原理是:首先人工合成某种酶裂解物的化合物,且化合物与发色物质,如与对硝基苯胺(PNA)相连接。待检样品中含有活性酶(原)或经样品中加入过量酶激活剂,在检测过程中发色物质被解离下来,被检样品中出现颜色变化,它与被检物质含量呈数量关系。生物化学法以酶学方法为基础,可直接定量,所需样品量小,测定结果准确、重复性好,便于自动化和标准化。凝血仪日前使用发色物质检测的指标大致分为3种模式,即对酶、酶原和酶抑制物进行测定。
2.3免疫学方法( immunology) 以被检物作为抗原,制备相应的单克隆抗体,利用抗原抗体的特异性结合反应对被检物质进行定量。自动凝血仪多采用免疫比浊法,它可通过透射或散射比浊分析。
2.4干化学技术( dry reagent technology) 这类分析方法主要用于床旁凝血分析。其原理是:用惰性顺磁铁氧化颗粒(paramagnetic iron oxide particles,PIOP)均匀分布并结合于可产生凝固或纤溶反应的干试剂中。PIOP可在一固定垂直磁场作用下移动。当血标本通过毛细管作用进入反应层后,可溶解干试剂,并发生相应的凝固或纤溶反应,同时与试剂结合的PIOP在反应过程中通过其移动或摆动幅度的大小而提供纤维蛋白形成或溶解的动力学特征。PIOP摆动所产生的光量变化通过光电检测器记录。然后通过信号放大、转换、计算而得到检测结果。
2.5超声分析(ultrasonic method) 这是一类利用超声波测定血浆体外凝固过程中血浆发生变化的半定量方法。在凝血分析过程中,以频率为210MHz~217Hz的石英晶体传感器作为信号的发射器和接受器。当血浆与相应试剂作用时,血浆凝固过程可使石英传感器的发射波产生相应的变化,通过接受、记录和分析这种变化而得到相应的结果。
3 自动凝血分析进展
3.1 多功能、自动化 现有的自动凝血分析仪大多可同时应用多种方法和原理(如凝固法、发色法和免疫法)进行分析,并已基本实现加样、试剂自搅拌、稀释样品、重复测定、控温、定标、感应样本或试剂液面的自动化。此外,可自动对密封的标本管穿刺吸样,如MDA180、CA6000等。实现自动化后,操作简便,可节省操作时间20%~50%以上。
3.2 精密度和准确度提高 凝血分析实现自动化以后,使止凝血检测项目的精密度和准确度较原有的手工法有了很大的提高,批内CV可控制在3%以内,批间CV可控制在10%以内。标准质量有了进一步改善,多点定标后所得标准曲线线性很好。
3.3 智能化 这一特征表现在其不仅可同时检测多个参数,而且可以对所检测的项目进行任意组合、随机检测、标本随时插入,实现了任选测试(random access)。不仅可对检测数据进行处理和对多种检测数据进行设置外,而且,还有质量控制(QC)系统确保分析结果的准确与可靠。
3.4 全自动化 凝血分析的全自动化是指利用全自动凝血仪、电脑、离心机、标本传送带、标本装卸系统等组成的全自动凝血分析工作站,实现凝血分析前、中、后过程的全自动化。最近Granves等利用MDA2180全自动凝血分析仪、移动式机器人、离心机等组建了一套全自动凝血分析工作站,可作为全实验室自动化(TLA)的一部分与其他自动化试验系统相结合。
3.5床旁分析( point of care) 这是自动凝血分析的又一进展,即使用微量全血进行快速、简便的凝血分析。这类分析仪目前主要用于检测凝血和纤溶的常规试验,如PT、APTT、Fg,有的可检测全血凝固时间(ACT),还有的可分析组织纤溶酶原激活物(t2PA),链激酶(streptokinase),尿激酶(urokinase)等。关于床旁凝血仪结果的精密度和准确度,Oberhardt等和Solomon等均分别有相关数据报道。从而表明,床旁凝血仪快速、简便,结果稳定,重复性好,能提供较可靠准确的过筛数据,并大大减少了完成试验所需的时间(TAT),尤其适应于抗凝和溶栓治疗的床旁监测。