DNA的酶切与连接
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(1)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl,10×Buffer 1μl,DNA 2μl,酶1μl,混匀,37℃水浴1h以上。
(2)取反应物点样,观察酶切效果。
(3)酶切完全后,70℃5min终止反应。
(4)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀,-20℃2h以上。
(5)15000rpm离心15min,弃上清。
(6)加入75%乙醇洗涤2次,离心弃上清,真空抽干。
(7)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
(8)测定DNA的含量。
(9)加入线性载体DNA和含量3~4倍于载体的待插入DNA片段,连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl,在12~14℃反应12~16h。
(10)连接反应液可置-20℃保存,供转化用。
(2)取反应物点样,观察酶切效果。
(3)酶切完全后,70℃5min终止反应。
(4)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀,-20℃2h以上。
(5)15000rpm离心15min,弃上清。
(6)加入75%乙醇洗涤2次,离心弃上清,真空抽干。
(7)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
(8)测定DNA的含量。
(9)加入线性载体DNA和含量3~4倍于载体的待插入DNA片段,连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl,在12~14℃反应12~16h。
(10)连接反应液可置-20℃保存,供转化用。