流式细胞术样本制备技术

单细胞是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。在应用流式细胞术中，制备出合格的分散单细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它既要求组织分散成为单个细胞，又要维持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。

一、流式细胞术样本制备的基本原则

1. 保证各种液体和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样本制备和检测。
2. 针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或者 EDTA 处理，以清除杂质，使黏附的细胞彼此分离形成单细胞状态。
3. 对新鲜实体瘤组织可选用酶消化法、机械打散法或化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液。
4. 对石蜡包埋组织应先切成若干 40~50μm 厚的蜡片，经二甲苯脱蜡至水后，再用前述方法制备单细胞悬液。
5. 单细胞悬液的细胞数不少于 10⁷个/mL。

二、流式细胞术实验操作大致分为以下五个步骤

1. 取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取肿瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存。
2. 对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色。
3. 按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储。
4. 依照软件提供的程序对检测结果进行定性定量分析。
5. 检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。

三、外周血液标本的制备

a）常规血液样本制备

1. 采集外周血，用肝素抗凝；采集后室温（25℃）保存，6 h 内处理；
2. 红细胞裂解液（ACK buffer）取出后，恢复至室温待用；
3. 流式管内加入 200 ul 外周血后，加入 3 mL 的 ACK buffer，室温孵育 3~5 min；
4. 加入 10 mL 细胞染色buffer(或含 1%BSA 的 PBS)终止红细胞裂解；
5. 300 g 离心细胞悬液 5 分钟，弃掉上清；
6. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)重复洗涤一次；
7. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL 备用。

b）外周血单个核细胞样本制备

1. 采集外周血 2 mL，用肝素抗凝，用生理盐水将血液稀释成 4 mL，混匀；
2. 15 mL 的离心管内，先加入等体积（4 mL）的淋巴细胞分离液；
3. 将稀释后的外周血沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合。务必保持清晰的分层状态；
4. 400 g 室温离心 20~30 min（根据血液样本量确定离心条件，建议先摸索一下条件以达到最好的分离效果）；离心后可见试管内血液清晰的分为4层，上层为血浆层，第二次为白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，底层为红细胞层；
5. 用吸管将第二层的淋巴细胞层小心的吸出收集到另 1 试管，用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS )清洗 2 遍，每次 250 g 离心 10 min；
6. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL 备用。

四、 骨髓细胞样本制备

a）常规骨髓细胞样本制备

1. 无菌抽取骨髓液 0.5 mL，用肝素抗凝；
2. 红细胞裂解液（ACK buffer）取出后，恢复至室温待用；
3. 骨髓液中加入 3 mL 的 ACK buffer，室温孵育 3~5 min；
4. 加入 10 mL 细胞染色 buffer(或含1%BSA的PBS)终止红细胞裂解；
5. 300 g 离心细胞悬液 5 分钟，弃掉上清；
6. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)重复洗涤一次；
7. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL 备用。

b）骨髓液单个核细胞样本制备

1. 无菌抽取骨髓液 0.5 mL；
2. 将骨髓液标本中滴入含 1000 U/mL 肝素抗凝剂的 1 mL PBS 液中；
3. 加入 PBS 稀释液将样本稀释至 10 mL；
4. 15 mL 的离心管内，先加入 5 mL 的淋巴细胞分离液；
5. 用吸管吸取 5 mL 的稀释后的骨髓液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液的液面上；
6. 400 g 室温离心 20~30 min（根据骨髓样本量确定离心条件，建议先摸索一下条件以达到最好的分离效果）；离心后可见试管内骨髓液清晰的分为 4 层，上层为 PBS 稀释液层，第二层为白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层 ，第四层为红细胞层；
7. 用吸管将第二层的淋巴细胞层小心的吸出收集到另 1 试管，用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)清洗 2 遍，每次300 g 离心 5 min；
8. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL 备用。

五、体液、灌洗液或悬浮培养细胞的制备

1. 采集新鲜体液、灌洗液或悬浮培养细胞；
2. 300 g 离心 5 min，收集细胞沉淀；
3. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)离心洗涤 1~2 次；
4. 若悬液中有明显的沉淀块，需用 200~300 目的滤网过滤后再用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)洗涤 1~2 次；
5. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整浓度至 1x10⁷/mL 备用。

六、贴壁细胞的制备

1. 吸除培养基上清液，用含无钙、镁离子的PBS漂洗一次；
2. 以 25 mL 培养基为例，加入 1 mL 消化液（0.1%胰蛋白酶），置室温（25℃）或 37℃ 消化 2~5 min；或者加入 1 mL 的 EDTA（0.02%,pH7.4）冰上静置 5~10 min；
3. 在倒置显微镜下观察，发现胞质回缩、间隙加大，立即吸除消化液并加入等倍体积含血清的培养基终止消化；
4. 吸取瓶内液体，反复吹打瓶壁细胞。吹打动作要轻柔并尽量避免产生泡沫；
5. 转移至离心管，300 g 离心 5 min，弃上清；
6. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)离心洗涤 1~2次；
7. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS )调整细胞浓度至 1x10⁷/mL 备用。

七、组织标本的制备

a）剪碎研磨法：

1. 将组织用 PBS 或无血清培养基漂洗干净；
2. 将组织置于平皿中，用眼科剪剪成小颗粒（1~2 mm³）；
3. 用注射器针芯研磨成匀浆；
4. 滴加适量的 PBS 或无血清培养基，用移液器吹打混匀；
5. 经 200~300 目滤网过滤，300 g 离心 5 min，弃上清；
6. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)离心洗涤 1~2 次；
7. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL备用。

b）网搓法

1. 将 300 目尼龙网扎在小烧杯上；
2. 把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加PBS冲洗，直至将组织搓完；
3. 收集细胞悬液，300 g 离心 5 min，弃上清；
4. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)离心洗涤 1~2 次；
5. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL 备用。

c）研磨法

1. 将组织剪成 1~2 mm³ 大小的组织块；
2. 放入组织研磨器中，加入 1~2 mL 的 PBS；
3. 转动研棒，研至匀浆；
4. 加入 10 mL 的 PBS，冲洗研磨器；
5. 收集细胞悬液，经 200~300 目尼龙网过滤，300 g 离心沉淀 5 min，弃上清；
6. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)离心洗涤 1~2 次；
7. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL 备用。

注意：1）以上方法为机械法，用于处理部分软组织例如胸腺、淋巴结等，对硬组织或纤维组织效果不好，并且对组织细胞有一定的损伤。

2）若组织为脾脏，可用研磨法处理后做红细胞裂解。在 300 g 离心沉淀 5 min 弃上清后，加入 3 mL 的 ACK buffer，室温孵育 3~5 min；再加入 10 mL 细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)终止红细胞裂解；后续操作同研磨法。

d）胰蛋白酶消化法：

适用于消化间质较少的组织，如上皮、肝、肾等组织，由于钙离子或血清会抑制胰蛋白酶的消化作用，此过程中使用的液体应不含这些离子或血清。消化时间根据不同情况进行调整，温度低、组织块大、胰蛋白酶浓度低，消化时间长；反之则缩短消化时间。胰蛋白酶常与 EDTA（0.02%）等比例混合使用可提高消化效率。

1. 将组织块用无钙、镁离子的 PBS 漂洗干净；
2. 将组织置于平皿中，用眼科剪刀剪成小颗粒（1~2 mm³）；
3. 加入 30 倍组织量的蛋白酶溶液（0.1% 胰蛋白酶和 0.02%EDTA 等比混合）；
4. 移液管转至三角烧瓶，置于37℃水浴或者恒温箱中消化 20~60 min，每隔5~10 min震荡一次。若需消化较长时间，可每隔 15 min 将 2/3 的消化上清液转移到离心管中冰浴或离心去除消化液，加入含血清培养基终止消化，另补充新的消化液至三角烧瓶中继续消化；
5. 将消化液或分批收集的细胞悬液经 200~300 目的滤网过滤，300 g 离心 5 min，弃上清；
6. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)离心洗涤 1~2 次；
7. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL 备用。

e）胶原蛋白酶消化法：

此法适用于分离纤维性组织、上皮及癌组织。钙、镁离子不会抑制消化作用，因此可用PBS或含血清培养基配制以提高细胞成活率。

1. 将组织块用PBS漂洗干净；
2. 将组织置于平皿中，用眼剪刀剪成小颗粒（1~2 mm³）；
3. 加入30倍组织量的蛋白酶溶液（0.1~0.3μg/mL 的胶原蛋白酶）；
4. 移液管转至三角烧瓶，置于 37℃ 水浴或者恒温箱中消化 4~48 h，每隔 5~10 min 震荡一次。亦可每隔 15 min 将2/3 的消化上清液转移到离心管中冰浴或离心去除消化液，加入含血清培养基终止消化，另补充新的消化液至三角烧瓶中继续消化；
5. 将消化液或分批收集的细胞悬液经 200~300 目的滤网过滤，300 g 离心 5 min，弃上清；
6. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)离心洗涤 1~2 次；
7. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL 备用。

注意：以上几种为最常见的实体组织样本单细胞制备方法，机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、化学法（酶和EDTA结合使用）对实体组织的分散解聚较理想，但对所测细胞化学成分可能存在不良影响，所以需结合实验目的选择合适的单细胞悬液制备方法。

八、石蜡包埋组织的流式细胞样本制备

外科手术获得的实体组织，大部分经过石蜡包埋处理。石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。

1. 将石蜡包埋组织切成 40~50μm 厚的组织切片 3~5 片，或者用乳钵研成 0.5 mm 直径大小的颗粒，放入 10 mL 的试管中；
2. 加入 5~8 mL 二甲苯，室温下脱蜡 1~2 天，视石蜡脱净与否，更换 1~2 次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；
3. 水化：依次加入 5 mL 的 100%、95%、70%、50% 梯度乙醇，每次 10 min；
4. 去乙醇，加入蒸馏水 3~5 mL，10 min 后弃之；
5. 消化：可加入 2 mL 的 0.5% 胰蛋白酶（pH1.5~2.0）消化液，置于37℃恒温水浴中消化 30 min，在此期间，每隔 10 min 用振荡器震荡 1 次；
6. 消化 30 min 后，加入含血清培养基终止消化；
7. 经 300 目尼龙网过滤，未消化好的组织可进行第二次消化；
8. 收集细胞悬液，300 g离心5 min，弃上清；
9. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)离心洗涤 1~2 次；
10. 用细胞染色 buffer(或含 1%BSA 的 PBS)调整细胞浓度至 1x10⁷/mL备用。

注意事项：

1. 新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织坏死或者细胞自融，影响 FCM 测定结果；
2. 酶学法要注意条件的选择和影响因素，同时注意酶的溶剂、消化时间、pH 值、浓度等方法对酶消化法的影响；
3. 不同的实体组织应选取不同的制备方法，如富含细胞的组织----淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及一些软组织肉瘤等，用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；
4. 在使用酶学方法时，应重视酶的选择，如含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，应选用胶原酶消化。