质谱样本制备技术资料

试剂耗材：

Milli-Q water、Non-powder gloves、Face mask、Hat、10μl and 200μl tips（eppendorf）、Menthol(Fisher M/4056/17)、Acetonitrile(Fisher A/0626/17)、Trypsin (Promega V528)、Trypsin resolve solution(Promega V530)、Ammonium bicarbonate（Sigma A6141）、ZipTip μC-18（Millipore ZTC18M096）、TFA(GE HealthCare)、0.2ml and 0.5ml EP tube(eppendorf)、50ml EP 0.5ml EP（Corning）

用具仪器：

真空干燥仪、水浴锅、10μ和200μ移液器、废液缸、制冰和装冰设备、200μ管架、剪刀、能装放置了200μ管管架的塑料盒、200μ管离心机。

准备：

1. 0.2ml EP管三套，MilliQ水和甲醇各涮一遍，真空干燥。

2. 50ml EP管六支，MilliQ水和甲醇各涮一遍，真空干燥。

3. 胰酶储液制备：使胰酶粉末沉落瓶底，用100μ胰酶重旋液溶解，用0.5ml EP分装成5μl。

4. 50ml 100 mM NH4HCO3。

脱色酶切：

1. 切点将200μl tip头剪成吸口1.5mm左右的直径，MilliQ水涮洗一遍，吸100μl水后戳取斑点，将胶粒打入0.2ml EP管中，吸干水后再用MilliQ水洗涤两遍，吸干。

2. 脱色 180μl 50%MeOH/50mM NNH4HCO3脱色两次以上，每次半小时；180μl MilliQ水洗涤5分钟，180μ 50% ACN洗涤5分钟，180μl 100%ACN洗涤5分钟；真空干燥半小时。

3. 酶切

① 25 mM NH4HCO3稀释胰酶至12.5μg/μl；每管胶粒加入胰酶3μl，冰浴15分钟后洗掉多余的胰酶；再加入3μl左右25 mM NH4HCO3至覆盖胶粒。

② 小心将EP管倒转，将整个EP管架放入塑料盒中后放入37度水浴锅酶切16小时。

③ 将塑料盒从37度水中捞出，注意不要倒掉水，冷却至室温。

④ 加入10μl 25 mM NH4HCO3，震荡15分钟，离心后收集至新管；

加入10μl 2.5%TFA，震荡5分钟，收集至上管；

加入10μl 2.5%TFA-50% ACN，震荡5分钟，收集至上管；

加入10μl 100% ACN，震荡5分钟，收集至上管。

⑤ 将此收集液真空浓缩至5-10μl后，加入20μl 0.5%TFA；继续浓缩至10-20μl。

肽段浓缩除盐：

1. 吸10μl 100% ACN，弃之，重复两次；

2. 吸10μl 0.1% TFA，弃之，重复两次；

3. 吹吸样本15次；

4. 吸10μl 0.1% TFA，弃之，重复两次；

5. 吸3μl 0.1% TFA-50% ACN，将此洗脱液转入新EP管。