材料与仪器
动物组织
乙酸缓冲溶液 葡萄糖醛酸酶 蛋白酶 氢氧化钾溶液 三氯乙酸 甲基叔丁基醚-环己烷
离心管 培养箱 超声水浴 硅烷化梨形瓶 色谱柱
乙酸缓冲溶液 葡萄糖醛酸酶 蛋白酶 氢氧化钾溶液 三氯乙酸 甲基叔丁基醚-环己烷
离心管 培养箱 超声水浴 硅烷化梨形瓶 色谱柱
步骤
1. 样品提取
取充分均质的组织样品10 g于100 mL玻璃离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L乙酸缓冲溶液，20 mg葡萄糖醛酸酶和蛋白酶，于均质器上均质1 min，置于培养箱中60培养1 min。冷却后加入15 mL 200 g/L三氯乙酸（采用广范围试纸，调pH1.5），在超声水浴上超声10 min。将提取液于10/15 ℃，4000 g离心15 min，若仍然存在悬浮物，温度可降低至8 ℃。倾出上清液，用20%氢氧化钾溶液调整pH至5.8～6.2，若在中和过程中出现沉淀，应进行过滤或再次离心。用200 g/L三氯乙酸淋洗电极，并入溶液中，并使总体积接近500 mL。移取20 mL 上述溶液于ISOLUTE HM-N柱中，平衡20 min。制备两份20 mL溶液，每份加入30 mL甲基叔丁基醚-环己烷（8 + 2），于100 mL硅烷化梨形瓶中，减压250 mbar，50 ℃旋转蒸发至干。
2. 净化
将ISOLUTE-Si汾置于SPE装置上，预先按顺序加4 mL乙酸乙酯，4 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80），抽干。用2 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80）溶解残渣，超声振荡，转移入柱。然后以4 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80）淋洗，弃去淋洗液。用4 mL乙酸乙酯-甲苯（65 + 35）洗脱并收集氯霉素组分。
2. 衍生化
收集溶液于40 ℃在缓慢氮气流下吹干。用200 uL乙酸乙酯转移入反应小瓶，加入20 uL内标溶液m-CAP，再次于40 ℃在缓慢氮气流下吹干。加入50 uL BSTFA-TMCS（99 + 1）溶液，用内衬聚四氟乙烯（PTFE）的螺旋盖盖紧，于60 ℃反应l h。冷却后，在氮气流下缓慢吹干。加入25uL异辛烷溶解残渣。供GC-MS测定。
3. 仪器条件
色谱柱：5%苯基、95%甲基硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25um；
柱温：程序升温，60 ℃（l min），以40 ℃/min，升至 l80 ℃ ，以8 ℃/min， 升至280 ℃，以5 ℃/min，升至300 ℃；
进样方式：脉冲，无分流；
进样器温度: 270 ℃ ；
载气：氦气；
接口温度：300 ℃；
离子源温度：l85 ℃；
NCI离子化模式；
反应气：甲烷，压力为533 Pa（4000mTorr）；
碰撞气：氩气，压力为0.27 Pa（2mTorr）；
电子能量: 200 eV；
碰撞电流: 200 mA；
CAP：m/z 466（70）、468（70）、376（30）、378（30）；
内标：m/z 47l（70）。
取充分均质的组织样品10 g于100 mL玻璃离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L乙酸缓冲溶液，20 mg葡萄糖醛酸酶和蛋白酶，于均质器上均质1 min，置于培养箱中60培养1 min。冷却后加入15 mL 200 g/L三氯乙酸（采用广范围试纸，调pH1.5），在超声水浴上超声10 min。将提取液于10/15 ℃，4000 g离心15 min，若仍然存在悬浮物，温度可降低至8 ℃。倾出上清液，用20%氢氧化钾溶液调整pH至5.8～6.2，若在中和过程中出现沉淀，应进行过滤或再次离心。用200 g/L三氯乙酸淋洗电极，并入溶液中，并使总体积接近500 mL。移取20 mL 上述溶液于ISOLUTE HM-N柱中，平衡20 min。制备两份20 mL溶液，每份加入30 mL甲基叔丁基醚-环己烷（8 + 2），于100 mL硅烷化梨形瓶中，减压250 mbar，50 ℃旋转蒸发至干。
2. 净化
将ISOLUTE-Si汾置于SPE装置上，预先按顺序加4 mL乙酸乙酯，4 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80），抽干。用2 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80）溶解残渣，超声振荡，转移入柱。然后以4 mL乙酸乙酯-甲苯（20 + 80）淋洗，弃去淋洗液。用4 mL乙酸乙酯-甲苯（65 + 35）洗脱并收集氯霉素组分。
2. 衍生化
收集溶液于40 ℃在缓慢氮气流下吹干。用200 uL乙酸乙酯转移入反应小瓶，加入20 uL内标溶液m-CAP，再次于40 ℃在缓慢氮气流下吹干。加入50 uL BSTFA-TMCS（99 + 1）溶液，用内衬聚四氟乙烯（PTFE）的螺旋盖盖紧，于60 ℃反应l h。冷却后，在氮气流下缓慢吹干。加入25uL异辛烷溶解残渣。供GC-MS测定。
3. 仪器条件
色谱柱：5%苯基、95%甲基硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25um；
柱温：程序升温，60 ℃（l min），以40 ℃/min，升至 l80 ℃ ，以8 ℃/min， 升至280 ℃，以5 ℃/min，升至300 ℃；
进样方式：脉冲，无分流；
进样器温度: 270 ℃ ；
载气：氦气；
接口温度：300 ℃；
离子源温度：l85 ℃；
NCI离子化模式；
反应气：甲烷，压力为533 Pa（4000mTorr）；
碰撞气：氩气，压力为0.27 Pa（2mTorr）；
电子能量: 200 eV；
碰撞电流: 200 mA；
CAP：m/z 466（70）、468（70）、376（30）、378（30）；
内标：m/z 47l（70）。
来源：丁香实验
