体外抗体形成细胞检测——液相小室法
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1969
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一、基本原理
溶血空斑试验,又称空斑形成细胞(Plague Forming Cell, PFC)试验,是一种体外检测抗体形成细胞的方法。将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔,四天后将小鼠杀死,取脾脏制成脾细胞悬液,内含抗体形成细胞。然后将脾细胞、绵羊红细胞,补体混合孵育。由于PFC所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原 抗体复合物,在补体作用下可使红细胞溶解,于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
二、实验材料
1. 解剖器械、试管、1ml吸量管
2. 载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器
3. ICR小鼠(北京大学 医学部实验动物中心提供)
4. 5%和10%绵羊红血球(SRBC)
5. 补体(豚鼠血清,经SRBC吸收,临用时稀释成合适浓度)
三、实验方法
1. 小鼠免疫及脾细胞悬液的制备:
将5%SRBC (0.4ml)注射于小鼠腹腔,4天后拉脱颈椎处死,取出脾脏放在已加入6ml Hank’s液的平皿中。在100目不锈钢网上研磨,过滤混匀,从中吸取lml加入试管中,加满Hank’s液混匀,离心1000rpm,10分钟。将沉淀的脾细胞恢复lml容积,即为约107/ml浓度的细胞悬液。
2.制作小室:
取无脂载玻片(75mm×25mm), 平置桌面上。用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条,然后再覆盖上同样的载玻片,即形成两个小室。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室的一边(无需浸入过深,以能封闭小室边缘为准)。
2. 小室灌注细胞悬液:
取107/ml脾细胞悬液100ml
10%SRBC 200ml
补体 200ml
Hank’s液 1m1
混匀后,用尖吸管灌注小室、蜡封、标记、平放于玻片盘内,置37℃孵箱30—45分钟。
四、实验结果
观察小室内的透明空斑,一个空斑即代表一个空斑形成细胞(PFC),即B细胞。
五、注意事项
(1) 小室注入液体时不要留有气泡。
(2) 小室边缘需用石蜡封严。
(3) 37℃孵箱孵育时,必须放平,不可倾斜。
(1) 观察结果时,应注意辨别空斑与气泡的区别,避免将气泡误认为溶血空斑。