体外抗体形成细胞检测——液相小室法

1、基本原理

溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cell, PFC）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。由于PFC所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。

2、实验材料

（1）解剖器械、试管、1ml吸量管；

（2）载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器；

（3）ICR小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）；

（4）5％和10％绵羊红血球（SRBC）；

（5）补体(豚鼠血清，经SRBC吸收，临用时稀释成合适浓度)。

3、实验方法

（1）小鼠免疫及脾细胞悬液的制备 将5％SRBC (0.4ml)注射于小鼠腹腔，4天后拉脱颈椎处死，取出脾脏放在已加入6ml Hank’s液的平皿中。在100目不锈钢网上研磨，过滤混匀，从中吸取lml加入试管中，加满Hank’s液混匀，离心1000rpm，10分钟。将沉淀的脾细胞恢复lml容积，即为约107／ml浓度的细胞悬液。

（2）制作小室 取无脂载玻片（75mm×25mm）, 平置桌面上。用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条，然后再覆盖上同样的载玻片，即形成两个小室。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室的一边（无需浸入过深，以能封闭小室边缘为准）。

（3）小室灌注细胞悬液 取107／ml脾细胞悬液100ml，10％SRBC 200ml，补体 200ml，Hank’s液 1m1混匀后，用尖吸管灌注小室、蜡封、标记、平放于玻片盘内，置37℃孵箱30—45分钟。

4、实验结果

观察小室内的透明空斑，一个空斑即代表一个空斑形成细胞（PFC），即B细胞。

5、注意事项

（1）小室注入液体时不要留有气泡；

（2）小室边缘需用石蜡封严；

（3）37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜；

（4）观察结果时，应注意辨别空斑与气泡的区别，避免将气泡误认为溶血空斑。