甲醇酵母表达实验的注意若干事项

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试验的注意事项

1、信号肽识别位点的设计

以质粒pPICZαA为例。在利用PCR反应在外源基因两端引入酶切位点的试验中。如果质粒pPICZαA双酶切中丢失了KEX2蛋白酶的酶切位点Lys-Arg，应该在上游中，增加了编码Lys、Arg的密码子AAA、AGA 。酵母细胞膜 中中的KEX2蛋白酶是α-factor信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点Lys-Arg，通过对信号肽的切割使基因表达产物释放至胞外。

2、PCR 产物酶切保护碱基的设计

利用PCR 转换酶切位点，通过P3、P4两引物的扩增在rhEGF的两端加上XhoⅠ、XbaⅠ的识别位点和5个保护碱基。

根据限制性核酸内切酶的工作原理，内切酶首先需要结合到核苷酸序列上，并在上面进行滑行，直至识别到酶切位点，为了能使内切酶有效的结合到序列上以利于其的有效加工。在利用PCR 进行酶切位点转换的时候，通常应在5'端限制酶位点外再加3个保护碱基GC，防止引物合成中因为合成效率和纯化问题而导致的酶切位点的残缺。

核苷酸 保护碱基之为了保证限制型内切酶的工作效率，在其识别位点的两侧应该保证一定的旁侧序列，换言之，识别位点是限制型内切酶识别并特异性切割底物的必要而不充分的条件。鉴于NEB(New England Biolabs)公司在限制酶领域的总体研究水平和对保护碱基方面的独到理解，在设计引物时可以参照NEB公司的产品目录后面的附录：Cleavage to the end of DNA fragments进行，但是，一些不常用的酶或虽有推荐的保护碱基序列但酶切效率仍不高的酶还是很难设计保护碱基。本次实验中，根据美国基因动力实验室文献的报道;XbaI、NheI和SpeI位点5’端保护碱基须在5个左右才容易被酶切割，以及一些前人的经验总结，我们在设计引物时在识别位点5’端，设计了5个保护碱基。以保证较高的酶切效率。

3、高保真DNA聚合酶的使用

Vent DNA聚合酶是从高温嗜热菌中分高出的高保真(High Fidelity)耐高温 DNA聚合酶，能纠正 DNA扩增中产生的错误，而传统的Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶及其变体 AmpliTaq，KlenTaq等都无3’至5’纠错功能，因此在扩增时出现碱基错配的机率为 2.1x104。这对于大批量的PCR产物而言，并不是十分严重的问题，因为又同样错误的DNA分子仅占全部合成的DNA分子群体的极少一部分。但是，如果PCR扩增的DNA片段是用于分子克隆，那么这就是件值得重视的事情，因为此种分子含有一个或数个错误掺入的核苷酸，那么在该克隆中的所有克隆DNA都将带有同样的“突变”。将会导致严重的后果。

具有校正功能的 DNA聚合酶还有Pfu，Deep Vent，Pwo，UlTma等，Pfu是其中出错率最低的，比Taq DNA聚合酶低10倍。在本论文中，为了减少hEGF 在 PCR过程的错误扩增，在人工合成hEGF的过程中使用了Vent DNA聚合酶。

随着PCR技术的不断发展成熟(扩增长度、保证性、产量和特异性等)，质粒构建过程的大多数细胞内的DNA复制将被PCR这一细胞外的DNA复制所代替，质粒构建效率将有质的飞跃。

4、密码子的偏好性的原则

酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析外源基因表达的规律有重要意义,也为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。

5、线性化及采用电转化的原因

在pPICZαA-EGF电转整合入GS115的时候，因为需要比较高的转染率，我们对其用限制性内切酶SacⅠ进行线性化的处理。

细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点。因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理。这种处理的目的：

(1)防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活;

(2)让同源重组以指定的方式发生。

6、乙醇沉淀法的问题

主要步骤如下：

1)酶切体系(80ul)中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀

2)-20℃ 20分钟沉淀

3)13200rpm，20min，离心后弃上清

4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清

5)37度烘箱至无乙醇气味(或是用摇床的出风口吹出的暖风吹)。

6)20ul ddH2O重溶

如果想提高转化效率，可以稍微做一些改进：

(1)还是用酚抽一下，去除内切酶;

(2)75%乙醇应洗两遍，尽可能去除盐离子，防止电转化杯被击穿，同时可提高效率;

(3)在沉淀时，如用终浓度2.5M的醋酸钠+2.5倍体积的无水乙醇，可沉淀几乎所有的DNA，但需要用75%的乙醇认真的洗两遍。

7、酶切的总结

影响重组质粒构建效率的最关键步骤在于酶切，不管是否是定向克隆还是非定向克隆。酶切的关键在于切干净，彻底的酶切反应是成功的一半，特别是载体的酶切，尤其是双酶切。

双酶切一般是先反应低盐buffer的、后反应高盐buffer的，如果低盐buffer的酶在高盐buffer的酶的反应条件下有低活性(一般来讲在NEB的手册上都有标示)，最好就先纯化(酚/氯仿抽提、乙醇沉淀)过，再进行第二次酶切反应。注意：有相同功能(如：切同一序列，并产生相同末端)的酶，不一定是相同的酶(结构、性质不同)。

双酶切失败有很多原因，先要看你抽的质粒有没有问题，你可以用2—3种确定单酶切的酶分别切质粒，如果都只有一条带就没问题;

再看你的双酶切的缓冲液是不是合适，如果你的双酶切条件不对，就会有大小不同的片断。有时后提供给你的缓冲液的理论值与实际有很大的差别。建议你回头检查一下你的质粒超螺旋是不是很好，酶切实在不行的话，就分开来切，顺便检查你的那一个酶，或者那一个酶切有问题。抽提质粒要注意溶液Ⅱ?处理时间不要超过5分钟，太长会有部分质粒不能复性，而且酶切不动。

酶切反应成功的前提是对质粒载体的大致定量，太多的载体用量对酶切效率有负面影响，而太少的质粒载体不能保证实验的需要。

8、如何减少PCR反应中的引物二聚体

减少引物形成二聚体的可能性：

1)退火温度设置不对，导致引物与模板的结合率降低。

2)引物设计不好，很容易形成二聚体。

如果碰到这种情况，可以尝试从以下几个方面解决：

(1)设计引物的时候

首先要熟悉引物设计的一般的原理，参考一些资料，积累经验。如果条件允许的话，可以用比较靠得住的引物设计软件验证我的引物，如果没问题，则进行下一步。

(2)改变退火温度

一般引物合成后厂家会提供其Tm值，可以根据这个温度为基准来做温度实验。如果你设计的引物里头有酶切位点和保护碱基，则此方法不行，可以用比较靠得住的引物设计软件来计算你引物中与模板结合部分的Tm值，然后以此为基准做温度实验。也可以根据自己的实际操作经验来解决问题。

(3)最后

建议换一下Taq酶，某些进口的Taq酶太严谨，导致引物二聚体的形成，这也是可能的。我们试验中一直都是使用某国产的Taq酶，效果挺理想。