甲醇酵母表达注意事项

试验的注意事项

1、信号肽识别位点的设计

以质粒pPICZαA为例。在利用PCR反应在外源基因两端引入酶切位点的试验中。如果质粒pPICZαA双酶切中丢失了KEX2蛋白酶的酶切位点Lys－Arg，应该在上游中，增加了编码Lys、Arg的密码子AAA、AGA 。

酵母细胞膜中中的KEX2蛋白酶是α-factor信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点Lys－Arg，通过对信号肽的切割使基因表达产物释放至胞外。

2、PCR产物酶切保护碱基的设计

利用PCR转换酶切位点，通过P3、P4两引物的扩增在rhEGF的两端加上XhoⅠ、XbaⅠ的识别位点和5个保护碱基。

根据限制性核酸内切酶的工作原理，内切酶首先需要结合到核苷酸序列上，并在上面进行滑行，直至识别到酶切位点，为了能使内切酶有效的结合到序列上以利于其的有效加工。在利用PCR进行酶切位点转换的时候，通常应在5'端限制酶位点外再加3个保护碱基GC，防止引物合成中因为合成效率和纯化问题而导致的酶切位点的残缺。

核苷酸保护碱基之为了保证限制型内切酶的工作效率，在其识别位点的两侧应该保证一定的旁侧序列，换言之，识别位点是限制型内切酶识别并特异性切割底物的必要而不充分的条件。

鉴于NEB(New England Biolabs)公司在限制酶领域的总体研究水平和对保护碱基方面的独到理解，在设计引物时可以参照NEB公司的产品目录后面的附录：Cleavage to the end of DNA fragments进行，但是，一些不常用的酶或虽有推荐的保护碱基序列但酶切效率仍不高的酶还是很难设计保护碱基。

本次实验中，根据美国基因动力实验室文献的报道；XbaI、NheI和SpeI位点5’端保护碱基须在5个左右才容易被酶切割，以及一些前人的经验总结，我们在设计引物时在识别位点5’端，设计了5个保护碱基。以保证较高的酶切效率。

3、高保真DNA聚合酶的使用

Vent DNA聚合酶是从高温嗜热菌中分高出的高保真（High Fidelity）耐高温 DNA聚合酶，能纠正 DNA扩增中产生的错误，而传统的Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶及其变体 AmpliTaq，KlenTaq等都无3’至5’纠错功能，因此在扩增时出现碱基错配的机率为 2.1x104。

这对于大批量的PCR产物而言，并不是十分严重的问题，因为又同样错误的DNA分子仅占全部合成的DNA分子群体的极少一部分。

但是，如果PCR扩增的DNA片段是用于分子克隆，那么这就是件值得重视的事情，因为此种分子含有一个或数个错误掺入的核苷酸，那么在该克隆中的所有克隆DNA都将带有同样的“突变”。将会导致严重的后果。

具有校正功能的 DNA聚合酶还有Pfu，Deep Vent，Pwo，UlTma等，Pfu是其中出错率最低的，比Taq DNA聚合酶低10倍。在本论文中，为了减少hEGF 在 PCR过程的错误扩增，在人工合成hEGF的过程中使用了Vent DNA聚合酶。

随着PCR技术的不断发展成熟（扩增长度、保证性、产量和特异性等），质粒构建过程的大多数细胞内的DNA复制将被PCR这一细胞外的DNA复制所代替，质粒构建效率将有质的飞跃。