甲醇酵母表达系统

互联网2013-11-15

1999

甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris 三种，其中Pichia Pastoris 作为基因表达系统使用得最多、最广泛^［1］。与以往的基因表达系统相比，它具有无可匹敌的高表达特性，已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。

1. 外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达
目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等(表1)。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一，但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10～100倍^［2］。如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L，而在甲醇酵母中为450mg/L，提高了60倍^［3］。椐报道，外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L^［9］。

表1 外源蛋白质在甲醇酵母中的高效产生

<center> <table> <tbody> <tr> <td> 外源蛋白质</td> <td> 产生量(g/L)</td> <td> 文献</td> </tr> <tr> <td> 转化酶</td> <td> 2.3</td> <td> ［4］</td> </tr> <tr> <td> D-丙氨酸羧肽酶</td> <td> 0.8</td> <td> ［5］</td> </tr> <tr> <td> α-淀粉酶</td> <td> 2.5</td> <td> ［6］</td> </tr> <tr> <td> Kunitz蛋白酶抑制剂(AbPP)</td> <td> 1.0</td> <td> ［7］</td> </tr> <tr> <td> 瞬时抗凝蛋白(TAP)</td> <td> 1.7</td> <td> ［8］</td> </tr> <tr> <td> 破伤风毒素片段C</td> <td> 12.0</td> <td> ［9］</td> </tr> <tr> <td> 百日咳抗原P69</td> <td> 3.0</td> <td> ［10］</td> </tr> <tr> <td> 人免疫缺陷病毒1膜外糖蛋白gp120</td> <td> 1.3</td> <td> ［11］</td> </tr> <tr> <td> 肿瘤坏死因子(TNF)</td> <td> 10.0</td> <td> ［12］</td> </tr> <tr> <td> 人转铁蛋白N端</td> <td> 4.0</td> <td> ［13］</td> </tr> </tbody> </table> </center>

2. 实现外源蛋白质高效产生的关键因素
2.1 表达载体首先，甲醇酵母中没有稳定的质粒，所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX 1)的启动子(P_AOX1 )和转录终止子(3′AOX1 )构建成整合型表达载体。P_AOX1 是一个极强的启动子，醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%^［2］，所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次，在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体，一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷，另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外，使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体，形成多个表达单元，产生高产的菌株，此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
2.2 受体菌在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，甲醇酵母中AOX 1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，诱导基因表达，使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件，细胞干重达100g/L以上，蛋白质产量极高^［14］。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型，从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。

3. 应用前景
经过近几年的发展完善，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入，它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。

表2 国内利用甲醇酵母产生的外源蛋白质

<center> <table> <tbody> <tr> <td> 外源蛋白质</td> <td> 产生量(g/L)</td> <td> 文献</td> </tr> <tr> <td> 人胰岛素</td> <td> 0.25</td> <td> ［15］</td> </tr> <tr> <td> 人胰岛素原</td> <td> 0.3</td> <td> ［16］</td> </tr> <tr> <td> 人p53蛋白</td> <td> 0.2</td> <td> ［17］</td> </tr> <tr> <td> 辣根过氧化物酶</td> <td> 4～6</td> <td> ［18］</td> </tr> <tr> <td> 人基质金属蛋白酶-9</td> <td> 0.01</td> <td> ［19］</td> </tr> </tbody> </table> </center>

参考文献

［1］李黄金等. 《生物工程学报》，1998，14(4)：337
［2］戴秀玉. 《微生物学报》，1997，37(6)：483--485
［3］彭毅等. 《生物技术通报》，2000，(1)：38
［4］Tschopp JF. Bio/Technology ，1987，5：1305-1308
［5］Despreaux CW et al. Gene ，1993，131：35--41
［6］Paifer E et al. Yeast ，1994，10：1415--1419
［7］Wagner SL et al. Biochem Biophys Res Commun ，1992，186：1138--1145
［8］Laroche Y et al. Bio/Technology ，1994，12：1119--1124
［9］Clare JJ et al. Bio/Technology ，1991，9：455--460
［10］Romanos MA et al. Vaccine ，1991，9：901--906
［11］Scorer CA et al. Gene ，1993，136：111--119
［12］Sreekrishna K et al. Biochemistry ，1989，28：4117--4125
［13］Cregg JM et al. Bio/Technology ，1993，11：905--910
［14］柴清等.《生命的化学》，1997，17(4)：36
［15］王燕等.《生物化学与生物物理学报》，1999，15(3)：587--589
［16］郭永志等.《生物工程进展》，1999，19(6)：64
［17］邱荣德等.《生物工程学报》，1999，15(4)：477
［18］蒋太交等.《生物化学与生物物理进展》，1999，26(6)：584
［19］颜红春等.《中国生物化学与分子生物学学报》，2000，16(2)：194