星天外A
最近在做这个系统,用BL21(DE3)做的细胞提取物,添加了除tRNA以外的组分,以pET21a为载体,没有表达出来。是因为没加tRNA吗,还有载体不适合,亦或是实验上有些要点我可能没注意到?有没有前辈指教一下,在这里先行谢过了。
loveliufudan
首先,确保您的质粒构建是正确的,包括检查您的DNA序列和构建方法是否正确。此外,您需要选择适合您的蛋白质的无细胞表达系统和载体,不同的蛋白质可能需要不同的系统和载体。
其次,确保您的转化和诱导条件是正确的。对于BL21 (DE3)菌株,常用的是IPTG诱导,但是有时过高或过低的IPTG浓度都会影响蛋白质表达。此外,您需要在合适的时间点收获细胞,不同的蛋白质可能需要不同的时间点。
最后,确保您的提取条件是正确的。您可以尝试使用不同的提取缓冲液,添加tRNA、细胞色素C等辅助因子来提高蛋白质表达。另外,您需要考虑蛋白质的可溶性问题,尝试使用不同的洗涤和溶解条件,以及添加融合标签或标记来提高蛋白质的可溶性和稳定性。
土井挞克树
建议更换载体,tRNA加入前是有阳性表现的,所以考虑是载体不合适。
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