🔥 芽孢杆菌表达系统

蛋白质表达技术是将克隆化基因插入合适载体后导入宿主细胞用于表达蛋白质的方法，按照宿主细胞来划分，蛋白质表达系统可以分为原核表达系统和真核表达系统两大类。

原核表达系统有大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等，真核表达系统有酵母菌表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物细胞表达系统。

其中芽孢杆菌表达系统作为基因工程表达系统，因具有外源蛋白易分离纯化、表达的外源蛋白不会形成包涵体、无致病性等多种优势而被广泛的研究和应用。

芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌和重要的原核表达宿主，细胞只有一层膜结构，分泌系统完善，可以直接将许多蛋白分泌到培养基中，表达的蛋白质产物不易形成包涵体，无需细胞破碎，无胞内蛋白污染，有利于后续分离纯化。

用于酶制剂、多肽类药物等多种外源蛋白的分泌表达。

大肠杆菌 DH5α、LB 培养基、2 mL EP 管、质粒提取试剂盒、芽孢杆菌相对应的培养基

1. 将目的基因连接到穿梭的表达载体上，载体中通常包含启动子、选择性标志基因和表达缩短型的蛋白质所需要用到的基因信息，转化到大肠杆菌 DH5α感受态中，涂在含相应抗性的 LB 平板上，37 ℃ 过夜培养。

2. 筛选阳性转化子，转入 LB 液体培养基中，37 ℃，200 rpm/min 培养 12~16 h，取 2~4 mL 菌液于 2 mL 的 EP 管中，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

3. 将冻存于 -80 ℃ 的芽孢杆菌菌液在 LB 平板上划线，放置于 37 ℃ 恒温培养箱中，过夜培养 12~16 h，挑取单菌落接种于对应的液体培养基中，制作芽孢杆菌感受态细胞。

4. 将重组质粒转化到芽孢杆菌感受态细胞中，涂对应的抗性平板，37 ℃ 培养过夜。

5. 挑取单克隆转化子进行鉴定，筛选出理想的目的菌株。

6. 将目的菌株接入 10 mL 液体培养基中扩大培养作为一级种子液。

7. 取 5 mL 的一级种子液接入 100 mL 液体培养基中，在 37 ℃ 培养至 OD600=0.8~1.0，加入诱导剂（诱导剂的终浓度为 1%），37 ℃，200 rpm/min 培养 12 h 结束发酵。

8. 取培养中不同时间温度表达的蛋白进一步做蛋白分析，选择最优的表达条件。

9. 进行放大培养并纯化蛋白。

（1）芽孢杆菌拥有很强的胞外蛋白分泌能力，其外源蛋白的表达量并不是很高，需要进行发酵条件筛选。

（2）接种量根据实验具体情况而定，诱导时间根据表达蛋白的具体情况而定，选择合适的表达温度和时间。

（3）芽孢杆菌最常见的诱导性启动子是受 IPTG 诱导的启动子和受木糖诱导的启动子。

（1）芽孢杆菌的野生菌会产生大量的胞外蛋白酶，容易使目标产物在被降解。因此可使用蛋白酶缺陷型菌株以提高外源蛋白的表达水平。

（2）注意表达载体缺乏，载体不稳定、蛋白质易变性等问题。