甲醇酵母表达载体及其元件

P.Pastoris表达载体及其元件

由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。

典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或 Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。

在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。

表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。

携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。

因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。

如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。所以，载体必须整合入酵母基因组中才能实现异源蛋白的稳定表达。

多数情况下，外源基因多拷贝整合可提高表达水平。

一般可采用如下3种方法建立多拷贝表达株：

①在表达载体中插入首尾相连的多拷贝表达盒；

②在表达载体中插入细菌Tn903Kan基因，因G418抗性水平与载体拷贝数呈正相关；

③应用含细菌Shble基因的表达载体，如pPICZ系列，该载体较小，易扩增，具有真光霉素抗性。

1、启动子

最常用的启动子是AOX1启动子(AOXl，promoter，PA0X)，它的甲醇诱导性很强，因而它控制下的外源基因能得到较高的表达。A0X1基因是从用RNA构建的cDNA文库中分离的，RNA来自克隆筛选能在甲醇培养基上生长的P．Pasotris细胞。

P．Pasotris基因组包含2个基因：AOX1和AOX2，编码乙醇氧化酶。在序列上这2种AOX蛋白同源性≥97％，并有相似特殊活性，但A0X1表达水平明显高于AOX2，即启动能力AOX1大大强于AOX2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由A0X1提供的。

当以甲醇为唯一的生长碳源时，AOX1基因的表达被甲醇严格调控，并被诱导到相当高的水平，可占整个细胞可溶蛋白的30％以上。AOX1和 AOX2同源性虽然高达97％，但AOX2只承担很少一部分活力。当A0X1基因缺乏而只存在AOX2时，大部分乙醇氧化酶的活力丧失，细胞利用甲醇能力降低。因此细胞在甲醇介质上生长很慢，这种菌株被称为Muts；A0X1基因存在时，细胞利用甲醇能力正常，在甲醇介质上生长较快，这种菌株表型被称为Mut+。

A0X1基因的表达为转录水平调控。 以甲醇为碳源时，生长细胞中约5％mRNA来自于A0X1基因。A0X1基因的调控是两步过程：抑制机制加上诱导机制。即在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转 录；而在以甲醇为唯一生长碳源时，诱导基因转录，蛋白表达。最近在P．Pasotris中克隆到一个组成型启动子：PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)，在它控制下的p.Lacz基因表达 率比甲醇诱导下的以PAOX1为启动子的产量更高。由于该组成型启动子不需甲醇诱导，发酵工艺更为简单，产量高，所以它是一个很有潜力的启动子。

2、选择标记

选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因，常用HIs4。由于P．Pasotris不利用蔗糖，所以也可用啤酒酵母的蔗糖酶基因suC2作为标记。AMP：氨苄抗性基因，可在大肠 杆菌中筛选。G418和Zeocinr(Invitrogen，sandiego，CA)也是筛选标记，使得到高拷贝的转 化子，这是因为表达载体上外源基因和卡那基因相偶联。Zeocinr在E.coli和P.Pastoris宿主中都表达，因此缩短了穿梭载体的长度，但Zeocin是一种强诱变剂，可能导致转化子产生突变。

3、信号肽序列

表达蛋白的分泌需要信号肽引导并沿一定途径才能分泌至细胞外。P.Pastoris自身分泌的蛋白质很少，分泌表达是一种理想的表达方式，胞外表达有利于蛋白质的提取和纯化，同时有助于不分泌型的蛋白质使其分泌，而像人血清蛋白(HSA)和牛凝乳酶(Rennin)，用自身信号肽序列即可在P．Pastoris中成功表达。然而，对于有些蛋白的自身信号肽，P.Pastoris不能有效利用，如反转录酶。

甲醇营养型酵母表达系统一般利用2种来源的信号肽序列：一是外源基因本身携带的信号肽序列；二是来源于酵母的信号肽序列，如a-因子、PHO1信号肽序列。P.Pastoris信号肽主要包括磷酸酶(PHO)、转化酶(inertase)和α-因子，其中α-因子信号肽( MF)使用最广。

α-因子信号序列是由87个氨基酸组成，来自于S.cerevsiae的α性成熟因子前导序列，并且已将这段序列编码的信号肽插入到几个P.Pastoris的表达载体中(Invitrogen)。在构建α-因子信号肽融合基因时，需保留KeX2蛋白酶切位点附近的谷氨酸一丙氨酸(Glu-Ala)间隔区，GluAla的存在会避免错误切割的发生。研究证明：信号肽引导的外源蛋白在P.Pastoris中均能被有效切割。α-MF是在高尔基体中被KeX2蛋白酶识别并切割，而PHO1一般在内质网被切割。

酵母细胞对信号肽序列的识别有一定的灵活性，在一定程度上可以识别外源蛋白的信号肽进行蛋白输送，但利用外源基因自身信号肽序列不能得到高表达量和高分泌效率。来源于P.pastoris酵母酸性磷酸酶(PHO1)基因的信号肽序列也常用于甲醇营养型酵母表达载体，由该信号肽引导的蛋白一般仅能分泌至膜周质，分泌效应不如a-因子信号肽强。

4、载体

（1）表达载体种类

有几种甲醇酵母是用于表达外源蛋白的受体菌，如GS115，KM71和SMD1168等，它们都是组氨酸缺陷型。如表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主的组氢酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8，通常不予考虑。GS115表型为Mut+。重组表达载体转化GS115后，长出的转化子既有可能是Mut+，又有可能是Muts，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。 SMDI168和Gsll5类似，不同的是它是蛋白酶缺陷型，可减弱蛋白酶对外源蛋白的降解作用。KM71没有AOX1基因，本身就是Muts，因此转化后所有的转化子都是Muts，不必鉴定表型。

Invitrogen公司构建的多种P.Pastoris表达载体，既有胞内表达的，又有分泌表达的。这些载体都包括一个表达盒(cassette)，它是由0.9 kb的5 ‘A0X1序列片断和约0.3 kb的转录终止基 因的3’序列组成。分泌型表达载体主要有pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6；胞内表达的载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)等。这些载体在结构上有共同点：

AOX1：含有AOX1启动子，可调控异源蛋白表达，同时也是载体和受体菌染色体发生重组的位点； 

McS：多克隆位点，允许外源基因插入；

Sig：编码N末端信号肽序列，可引导蛋白分泌；

1vr：转录终止和多聚腺苷酸化序列，允许mRNA有救转录终止和多聚腺苷酸化

3’AOx1：TT序列下游区域，同源重组位点之一；

His：编码组氨酸，提供转化子的筛选标记，也是重组位点之一；

Amp：氨苄抗性基因，允许在大肠杆菌中筛选。

按Invitrogen公司推出的Kit可分为3类。第一类属高拷贝型：如 pPIC3K和pPIC9k都携带有卡那基因，可通过提高G418浓度，很容易得到高拷贝的转化子。 PA0815是先在体外构建串联的外源基因多拷贝(可连接8个拷贝子)，转化后可得到已知的多拷贝转化子。第二类为易筛选型：pPIczA，pPIcza，不需要营养缺陷筛选、不需要氨苄抗 性筛选，且载体小，易操作。但是筛选标记为Zeocin，它是很强的诱变剂，可使外源蛋白突变。第三类为原始型：pPIc9等操作繁琐，是单一拷贝，有高水平表达外源蛋白的时候，但不多见。

酵母表达载体有多种，采用较多的是整合型表达载体，可通过整合型载体将外源基因整合到酵母染色体上，获得遗传性稳定重组子，而且能通过前导信号肽引导外源蛋白的分泌表达。并能识别及有效地切割这些信号肽。外源基因在酵母中的表达一般是采用酵母基因的启动子。目前，利用最多的是美国Invitrogen公司出售的毕赤酵母表达载体和相应的试剂盒。该公司构建了多种甲醇酵母表达载体，既有胞内表达的，又有分泌表达的，该种表达载体表达外源蛋白时，需要加人甲醇进行诱导，不利条件是在表达产物中引人了有毒的甲醇。

典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或 Zeocin)、 3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。

pGAP系列表达载体

美国 Invitrogen公司的产品 pGAeZ和 pGAPza，是一种无需甲醇诱导而能表达外源蛋 白的毕赤酵母载体。pGAP系列是典型的组成型酵母表达载体，为穿梭型表达载体，能在大肠杆菌和酵母中进行遗传复制。是以毕赤酵母中磷酸甘油酸脱氢酶(GAP)基因启动子作为外源基因启动子，该启动子是组成型表达的，所以不存在诱导的问题，在以葡萄糖为碳源的培养基上就可以表达。通过利用美洲小长尾猴重组a-1,3半乳糖转移酶，来表达 a-半乳糖抗原，在P／ch／a pastor／s酵母中获得了表达。是在PGAP启动子的启动下，分泌到培养基中，并且表达产物与6×His尾巴相融合，以利于纯化。同时，由于不用加人甲醇进行诱导，所以在表达产物中不会引人有毒物质，有利于表达产物的商品化。

（2）表达载体的整合方式

整合载体转化受体菌时，可以和染色体上的相应位点发生互换，从而整合到酵母菌染色体上。通常有以下几种整合方式：

①双位点互换。发生在染色体AOX1或 GAP位点和表达质粒中的PAOX1或 PGAP及转录终止区，产生的表达菌的表型为His+Mut+。

②AOX1或GAP单位点互换。发生在染色体和表达质粒的AOX1或GAP区，外源基因的表达单位插人在染色体 AOX1或GAP基因的上游或下游，这一过程可重复发生，使得更多拷贝的表达单位插人到基因组中，产生的表型是His+Mut+。

③His单位点置换。发生在染色体 His位点和表达质粒的 His位点，使得1个或多个表达单位插人在 His位点，产生的表型也是His+Mut+。