ELISA实验原理及注意事项。

ELISA是将抗原或抗体结合在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性结合以及抗体或者抗原上标记的酶催化特定底物发生显色反应，实现目标物检测的免疫分析方法。

类型

直接法：将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。

间接法：将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原一待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。

夹心法，类型：分为直接夹心和间接夹心。检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。直接夹心又分为双抗体夹心和双抗原夹心。夹心ELISA实验需要用到配对抗体（捕获抗体和检测抗体），原理：将捕获抗体结合到ELISA板上，通过捕获抗体固定抗原，随后通过直接或间接ELISA的方式进行检测。在夹心ELISA实验中，最重要的是对配对抗体进行验证，确保配对抗体能同时与抗原结合，以确保实验的顺利进行。

竞争法：首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。

注意事项：

1. 试剂盒使用前室温平衡20-30分钟

温度是ELISA结合反应的重要影响因素，实验前务必将所有的试剂平衡至室温。

2. 规范加样。

3. 标准品的溶解与稀释，严格按说明书要求进行。

a. 粉末标准品短暂离心，让沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。

4. 标准品和样本做复孔

复孔可以计算检测结果平均值，使实验结果更准确；通过复孔结果对比，评估试剂盒的精密度及实验中是否存在误操作；

5. 震荡

a. 孵育过程震荡，可以加快、加强抗原抗体之间的相互碰撞接触，使得反应更加完全，OD值通常比未震荡孵育的结果要高；

b. 洗涤过程中震荡，可以使洗板更干净，很大程度上降低背景值，同时提高试剂盒检测的灵敏度。

6. 洗涤操作

a. 手工洗板，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；

b. 扣干后的酶标板应立即加液，不能干板太久。

检测

酶标仪使用前务必预热10-15分钟，使结果更稳定；

ELISA的原理:ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体 表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA全称为酶联免疫吸附试验，是一种酶标固相免疫测定技术。其基本原理是将抗原或抗体结合到固相载体上，并将抗原或抗体与某种酶连接成酶标记抗原或抗体。在检测时，将待检样本和酶标记抗原或抗体按一定程序与固相载体上的抗原或抗体反应，然后用洗涤的方法去除未反应的部分，加入底物后，底物被结合在固相载体上的酶催化产生有色物质，通过定性或定量检测有色产物量，可确定样品中待测物质含量

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

一、ELISA样本的处理

ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制，在收集标本前都必须有一个完整的计划

注意事项

1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x2

2、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融

3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。

4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色

5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存

ELISA 原理方法操作和注意事项

1. ELISA 的原理

 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA操作的注意事项

◎加样应用微量移液器（加样枪）按规定的量加入微孔板的1/3处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

◎每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染。

◎样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。

◎如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。

elisa实验的注意事项：

1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

2.在elisa操作步骤中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：固相载体的选择、包被抗体(或抗原)的选择、酶标记抗体工作浓度的选择、酶的底物及供氢体的选择

酶联免疫吸附测定（ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于定量或定性检测样品中的抗原或抗体。

ELISA的原理：

基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，并结合酶催化的显色反应，以检测样品中的目标物质。

注意事项：

1. 避免交叉污染：实验过程中应确保操作者的手、实验器具和试剂的干净，避免不同样品之间的交叉污染。

2. 洗涤充分：洗涤过程对于ELISA实验非常重要，应确保充分洗涤，以去除未结合的抗原或抗体及杂质。

3. 温度和时间：ELISA实验中的温度和时间可能会影响结果的准确性，因此应严格按照实验操作规程进行操作。

4. 试剂稳定性：确保试剂的稳定性，尤其是酶标记的二抗和底物，因为它们容易失活。

5. 标准曲线的制备：为了准确定量样品中的抗原或抗体浓度，需要制备标准曲线。标准曲线应具有良好的线性关系，且覆盖实验样品的浓度范围。

6. 结果分析：根据吸光度值与标准曲线对比，计算样品中抗原或抗体的浓度。注意背景值的影响，并进行适当的校正。