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以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库筛选的常规实验方法

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以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库筛选的常规实验方法
 
    (1)大肠杆菌KglKan的活化:用无菌接种针从菌种甘油保存液中蘸取少量菌液,划线接种于LB-Kan平板上,翻转平板,于37℃培养过夜;次日培养平板用石蜡膜封口后,在4℃中保存不超过1个月。
 
    (2)大肠杆菌K91Kan感受态细胞的制备:取lmlLB液体培养基于15m1指管中,加入1ulKan(100ug/m1),从培养平板中挑选大肠杆菌K91Kan的单菌落接人LB液体培养基中,37℃震荡(~230r/min)培养过夜;将1 m1的K91Kan培养液转入10m1TB溶液中(1:10)继续震荡(~230r/min),培养至对数生长期(A600 =0.45,如1:10稀释则A600=0.2),约2-2.5h。再37℃慢速震荡(~100r/min)培养约5min,即为感受态细胞,在1 h内使用。
 
    (3)噬菌体的扩增和纯化:将待扩增的噬菌体(~1011 颗粒)加人到10m1感受态细胞中,37℃,慢速震荡(~100r/min)培养15min将培养物转入100ml的LB-0.02%Tet中,37℃震荡(~230r/min)培养30min,加入100/A1Tet母液(终浓度为20ug/m1),37℃震荡(~230r/min),继续培养24h。培养物于4℃,8 000r/min离心15min,将上清液转入到另一干净的有盖三角烧瓶中,加入1/6体积的PEG/NaCl,充分混合(上下颠倒一100次),4℃沉淀过夜。次日,4℃、10 000r/min离心40min,弃去上清液,沉淀用1m1的TBS溶液充分溶解。4℃、8 000r/min离心10min,将上清液转人另一个干净的小离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl充分混合置于4℃下沉淀4h以上。然后4℃、8 000r/min离心10min,沉淀用200/il的TBS溶液充分溶解,最后加入0.7%二甲基亚砜与0.02%叠氮化钠,离心1min,以除去一些不溶的物质,-30℃保存。
 
    (4)噬菌体效价的测定:本实验采用噬菌体转染大肠杆菌K91Kan形成的转导子数目(丁U)来进行噬菌体的定量:制备大肠杆菌K91Kan感受态细胞,用TBS明胶将噬菌体10×系列稀释(参考稀释范围:一2X106病毒 颗粒/ml,即~105TU/m1)。取一无菌15m1指管,使其与水平成10~角,在近管口的内壁加10ul感受态细胞。直接在10ul感受态细胞的液滴中加入10ul稀释后的噬菌体溶液,慢慢竖直指管,使液滴到管底时充分混匀感受态细胞和噬菌体,室温孵育10min,使噬菌体感染大肠杆菌。然后加入1 ml的LB-0.2 ug/m1 Tet,37℃震荡(~230 r/min)继续培养20~40 min,以100u1/块平板,取培养液涂在LB-Tet40-Kanl00平板上,倒置平板于37℃培养一24h。次日,计算平板上的菌落数(y)及噬菌体的效价:
噬菌体的效价=y×l0n+3 (TU/ml)
  式中10n 为稀释倍数。
 
    (5)噬菌体DNA的提取:扩增单克隆噬菌体后,取500ul含有噬菌体的上清液,加入200ulPEG/NaCl,充分混合,室温静置10min,4℃、10 000r/min离心10min。去上清液,重新离心,尽量吸去剩余的上清液。加入100ul碘化物缓冲剂彻底溶解沉淀,再加入250ul乙醇,室温孵育10 min,大部分噬菌体蛋白存在于溶液中,沉淀单链噬菌体DNA 4℃、10 000r/min离心10min。去上清液,加入70%乙醇洗沉淀,真空干燥,加入30ulTE缓冲液溶解沉淀,即为噬菌体DNA溶液。
 
    (6)噬菌体DNA序列的测定和分析:由专门公司完成。
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