以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库筛选的常规实验方法
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以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库筛选的常规实验方法
(1)大肠杆菌KglKan的活化：用无菌接种针从菌种甘油保存液中蘸取少量菌液，划线接种于LB-Kan平板上，翻转平板，于37℃培养过夜；次日培养平板用石蜡膜封口后，在4℃中保存不超过1个月。
(2)大肠杆菌K91Kan感受态细胞的制备：取lmlLB液体培养基于15m1指管中，加入1ulKan(100ug/m1)，从培养平板中挑选大肠杆菌K91Kan的单菌落接人LB液体培养基中，37℃震荡(～230r/min)培养过夜；将1 m1的K91Kan培养液转入10m1TB溶液中(1：10)继续震荡(～230r/min)，培养至对数生长期(A600 =0．45，如1：10稀释则A600=0．2)，约2-2．5h。再37℃慢速震荡(～100r/min)培养约5min，即为感受态细胞，在1 h内使用。
(3)噬菌体的扩增和纯化：将待扩增的噬菌体(～1011 颗粒)加人到10m1感受态细胞中，37℃,慢速震荡(～100r/min)培养15min将培养物转入100ml的LB-0．02％Tet中，37℃震荡(～230r/min)培养30min，加入100/A1Tet母液(终浓度为20ug/m1)，37℃震荡(～230r/min)，继续培养24h。培养物于4℃，8 000r/min离心15min，将上清液转入到另一干净的有盖三角烧瓶中，加入1/6体积的PEG/NaCl，充分混合(上下颠倒一100次)，4℃沉淀过夜。次日，4℃、10 000r/min离心40min，弃去上清液，沉淀用1m1的TBS溶液充分溶解。4℃、8 000r/min离心10min，将上清液转人另一个干净的小离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl充分混合置于4℃下沉淀4h以上。然后4℃、8 000r/min离心10min，沉淀用200/il的TBS溶液充分溶解，最后加入0．7％二甲基亚砜与0．02％叠氮化钠，离心1min，以除去一些不溶的物质，-30℃保存。
(4)噬菌体效价的测定：本实验采用噬菌体转染大肠杆菌K91Kan形成的转导子数目(丁U)来进行噬菌体的定量：制备大肠杆菌K91Kan感受态细胞，用TBS明胶将噬菌体10×系列稀释(参考稀释范围：一2X106病毒 颗粒/ml，即～105TU/m1)。取一无菌15m1指管，使其与水平成10~角，在近管口的内壁加10ul感受态细胞。直接在10ul感受态细胞的液滴中加入10ul稀释后的噬菌体溶液，慢慢竖直指管，使液滴到管底时充分混匀感受态细胞和噬菌体，室温孵育10min，使噬菌体感染大肠杆菌。然后加入1 ml的LB-0．2 ug/m1 Tet，37℃震荡(～230 r/min)继续培养20～40 min，以100u1/块平板，取培养液涂在LB-Tet40-Kanl00平板上，倒置平板于37℃培养一24h。次日，计算平板上的菌落数(y)及噬菌体的效价：
噬菌体的效价＝y×l0n+3 (TU/ml)
式中10n 为稀释倍数。
(5)噬菌体DNA的提取：扩增单克隆噬菌体后，取500ul含有噬菌体的上清液，加入200ulPEG/NaCl，充分混合，室温静置10min，4℃、10 000r/min离心10min。去上清液，重新离心，尽量吸去剩余的上清液。加入100ul碘化物缓冲剂彻底溶解沉淀，再加入250ul乙醇，室温孵育10 min，大部分噬菌体蛋白存在于溶液中，沉淀单链噬菌体DNA 4℃、10 000r/min离心10min。去上清液，加入70％乙醇洗沉淀，真空干燥，加入30ulTE缓冲液溶解沉淀，即为噬菌体DNA溶液。
(6)噬菌体DNA序列的测定和分析：由专门公司完成。
