以蛋白分子为靶目标噬菌体肽的鉴定
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以蛋白分子为靶目标噬菌体肽的鉴定
(1)ELISA 鉴定：用牙签轻触筛选到的并单克隆化的含噬菌体单菌落，将其投入已放有1m1 B-Kanl00-Tet40液体培养基的15ml试管中，37℃震荡(270r/rain)培养24h。离心除去菌体，得到上清液，即单克隆的噬菌体，可直接用于鉴定。将单克隆抗体用CBS稀释成一定浓度，以100ul/孔包被96孔酶标板，于4℃下包被过夜(或37℃孵育2 h)。加入200ul/孔洗板液(PBST05)静置5min，甩去洗板液，重复洗5次，以下的洗板操作都与此相同。加入封阻液(PBST05-1％BSA)200ul，于37℃孵育1h。加入洗板液(PBST05)，洗板5次。在酶标板中分别加入上述扩增的单克隆化噬菌体上清液，每种噬菌体作复孔，并用无关噬菌体扩增后的上清液作为阴性对照，37℃孵育lh。加入洗板液(PBST05)，洗板5次。将酶标兔抗噬菌体M13抗体用封阻液(PBST05)％BSA)稀释至工作浓度，分别加入酶标板中，100ul/孔，于37℃孵育1h。加入洗板液(PBST05)，洗板5次。每孔加入新鲜配制的邻苯二胺(OPD)底物显色液，100ul/孔，于37℃孵育至出现明显的颜色反应。最后每孔加入50ul酶终止液以终止反应，用酶标仪测定每孔的A490值，选择A49。值比阴性对照高出5倍的噬菌体克隆作为阳性噬菌体。
(2)竞争ELISA方法鉴定：反应最适浓度的测定采用倍比稀释McAb、单克隆噬菌体上清液，用棋盘滴定法得到抗原与抗体呈线性关系的浓度范围，可以取线性关系中点处的(也可取A490值为l时的)相对应抗原―抗体浓度作为反应最适浓度。用这个最适的抗原―抗体浓度进行反应后，其A490值应是固定值。用最适浓度的抗体包被96孔酶标板，如上述ELISA洗板、封阻。每孔加入2×最适浓度的单克隆噬菌体上清液50ul和系列倍比稀释的天然抗原50ul，设阳性对照孔为加入2X最适浓度的单克隆噬菌体上清液50ul和50ulPBS，37℃孵育1h，洗板。加入酶标兔抗噬菌体M13抗体，37℃孵育1h，洗板。显色后测定A49。值，与阳性孔比较以A49。值下降50％或50％以上的为目标噬菌体。
(3)用点印迹方法鉴定：将目标噬菌体用点样器点在硝酸纤维素膜(NC)纸上，待第一次样品变干后重复点样2～3次。将NC纸转入已放有1％BSA―PBST的热封口袋中，37℃慢摇孵育1h，进行封阻。将NC纸放人TBS中漂洗3次，3min/次，依次将NC纸与一定浓度的McAb和酶标羊抗鼠抗体进行孵育。将漂洗过的NC纸转入DAB底物显色液中，等到出现明显的条带后将NC纸取出，用清水稍加漂洗自然干燥后保存。
(4)用蛋白质印迹(Western blotting)方法鉴定：将目标噬菌体依照上述噬菌体的扩增与纯化的方法大量制备，采用12％胶浓度进行SDS―PAGE，上样量为10ul/孔，恒压120V、l.5h。将电泳好的一块凝胶进行染色，以显示噬菌体的电泳全条带，然后将电泳好的另一块凝胶转入电转移缓冲液中平衡20rain。最后采用NC纸、恒压100V、50min进行电转移。电转后将凝胶进行染色处理，NC纸放人丽春红S染液中染色5min，以观察蛋白质条带转移的情况。如果转移得比较好，将NC按照操作方法进行显色。按照上述方法用兔抗M13血清显示噬菌体蛋白质全条带。
(5)对目标噬菌体进行DNA序列测序：噬菌体单克隆扩增后，提取噬菌体单链DNA由专门公司测定。
