以器官和组织为靶目标的噬菌体肽筛选

一、实验材料

① 肽库：美国NewEnglandBiolabs的环状7肽库(Ph，D-C7CTm Phage Display Peptide LibraryKit)。

② 人正常细胞株和人肿瘤细胞株。

③ 裸鼠。

二、实验器材和常用试剂

同蛋白质分子为筛选靶目标的实验方法。

三、实验方法

1. 目标噬菌体的初筛

① 荷瘤裸鼠动物模型的准备：选用4～6周龄雌性健康BALB/c裸鼠数只，于SPF级动物实验室常规无菌培养，待用。选取生长状态良好的肝癌细胞，胰蛋白酶常规消化后用含有20%新生牛血清的RPMll640完全培养基重悬，细胞计数后，调节细胞浓度达到107 个细胞/ml。

将重悬好的细胞，用1ml的无菌一次性注射器在裸鼠右侧腋下，采用皮下注射的方法将200ul(约5×106 个)的肿瘤细胞注射到裸鼠体内。约3～4周后肿瘤达到可供使用的大小。

② 荷瘤裸鼠经乙醚麻醉后，将1011噬菌体肽文库静脉注射人荷瘤裸鼠体内(这些噬菌体经过血液循环后，含肝癌细胞特异性肽的噬菌体将会吸附于肝癌细胞上或被癌细胞内吞)，5min后用10ml的DMEM、100ml生理盐水对小鼠进行心脏灌流。

取出裸鼠一部分肿瘤组织用PBS洗3次，研磨后，加入20 ml预先制备好的大肠杆菌感受态细胞，37℃、230r/rain振荡培养4.5h，分别检测从肿瘤回收的噬菌体及其扩增后的效价。

③ 荷瘤裸鼠继续用多聚甲醛固定液灌流至肝脏变白，取下荷瘤裸鼠的主要器官和一部分肿瘤组织，浸入3%多聚甲醛固定，以备组织切片用。

④ 从裸鼠的肿瘤组织回收噬菌体含有能特异性吸附于肿瘤组织的多肽，对回收得到的噬菌体库用上述相同的方法再进行1次体内循环筛选，即得到了初筛的目标噬菌体。

2. 噬菌体单克隆的扩增及纯化：同以细胞为靶目标的筛选。

3. 目标噬菌体克隆的鉴定

① 噬菌体在体内组织分布的免疫组织化学鉴定：取出浸在3%多聚甲醛中的组织样品，自然干燥后，切片后贴到玻片上，晾干，丙酮固定5rain，PBST洗3次，每次3min。1%过氧化氢甲醇混合液室温浸泡30min，PBST洗3次，每次5min。

5%脱脂奶粉室温封阻20rain，加入按1：1 000稀释的噬菌体M13抗血清，37℃湿盒中温育1h，PBST洗3次，每次5rain。加入1：300稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃湿盒中温育1 h，PBST洗3次，每次5rain。

DAB进行显色反应(约12 rain)，用流水终止反应；苏木青复染细胞核约3rain，自来水冲洗；加饱和碳酸锂分色，用乙醇逐级脱水，二甲苯3rain透明，最后用中性树脂封片观察。

② 体外培养细胞水平的鉴定：同以细胞为靶目标的筛选。