以细胞为靶目标的噬菌体肽筛选材料与方法
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以筛选人肿瘤细胞特异性结合肽为例。
1．实验材料
(1)肽库：美国NewEnglandBiolabs的环状·肽库(Ph．D.-C7CTm Phage Display Peptide Library Kit)。
(2)人正常细胞株。
(3)人肿瘤细胞株。
2．实验器材和常用试剂
同蛋白质分子为筛选靶目标的实验方法。
3．实验方法
(1)细胞常规培养。
(2)以细胞为靶目标的筛选：选择生长状态良好、覆盖面达到80％的肿瘤细胞一瓶(细胞总数约5×106 个)，倾去原有的培养基后换上无血清培养基孵育1 h(以去除培养基中血清对筛选的影响)，然后用洗脱液PBST05充分洗脱3―5遍，去除杂蛋白的干扰，加入用PBST05稀释到1011 /ml的噬菌体库约1m1后继续孵育1h，再次用PBST05充分洗脱3～5遍，去除未结合的噬菌体克隆。最后采用细胞刮刀收集贴壁的细胞以及结合在上面的候选噬菌体，取小部分进行效价测定的同时，将剩余的收集物加入预先准备好的感受态细菌中进行扩增，然后采用常规的纯化方法扩增后进行第二轮的筛选。随后为了去除所筛选克隆中与正常细胞能够发生结合的噬菌体，可以采用正常细胞作为阴性选择对象，采用类似的方法进行反向筛选，所不同的是在噬菌体与细胞充分孵育之后保留的是没有与正常细胞发生结合、上清液中的噬菌体，而将能够与正常细胞结合的噬菌体去除。最后一次筛选后，按上法进行噬菌体的单克隆化。
(3)单克隆噬菌体的扩增及纯化：将2ml含有2ul四环素(20mg/ml)的LB液体培养基加入15m1的试管中，挑选新鲜的大肠杆菌ER2738单菌落，37℃、230r/min振荡培养过夜，将2m1ER2738培养液转入20m1 LB溶液中继续培养50min，然后37℃、100r/min振荡培养15min，即成为感受态细胞。加入噬菌体后，继续37℃、100r/min培养10min，再转到37℃、230r/min的条件下继续培养4．5h，培养物于4℃、8 000r/min离心15min，取上清液加入1/6体积的PEG―NaCl于4℃沉淀过夜。将溶液于4℃、10 000 r/min离心20min，弃上清液，沉淀加入1 m1TBS，充分溶解后于4℃、10 000r/min离心10min，以去除剩余的菌体，将上清液转入另一干净的小离心管中，加入1/6体积的PEG―NaCl充分混合并置于4℃下沉淀1h。离心后用少量的TBS溶解，60℃水浴中放置20min，加入0．7％二甲基亚砜和0．02％叠氮化钠，于一30℃保存备用。
