体内随机噬菌体展示文库的筛选

体内随机噬菌体展示文库的筛选

材料

试剂

麻醉剂

B A L B /c 小 鼠（2 月龄）

尽管性价比低，但裸鼠仍是最好的选择，它能将皮毛相关的菌的交差污染降到最低。大部分分离的配体的受体在不同的小鼠株中不同。

D M E M 组织培养液

K 91 kan 菌

任何其他的 F 菌毛阳性的 M - Zi 菌都可用于嗟菌体扩增。

卡那霉素

L uria b ro th 培养基

N Z Y b r o th 培养基

噬菌体展示随机多肽库

職菌体展 ZTC 随 机 多 肤 库 的 传 代 和 生 产 已 经 随 处 可 见（Smith and Scott 1993; Koivunen etal. I” 9 ) 。 不同载体的几种文库已商品化。合 适 文 库 的 组 成 有 超 过 IO⁸个不同的噬菌体多肽序列。通 常 ，长 度 小 于 9 个自由残基的多肽能产生较好的亲和配体被优先用于选择。较大的文库插人序列的多样性很大而不适用于实际应用。在体内靶向后的每一步对噬菌体文库的质量控制都是特别关键的。如果考虑到没有插入或者噬菌体克隆的突变，扩增文库(相对于初级文库）并不一定能够使用。

聚乙二 醇（P E G )/氯化钠 N a C l

溶 解 IOOg PEG8000 和 IlOg NaCl 于 450 ml 水中，剧烈振摇，髙压锅灭菌后，边冷却边摇动。

磷酸盐缓冲液（P B S )

c o c k ta il 蛋白酶抑制剂（R oche)

T B supplement

溶解 11. 55 g KH2PO4 和 l 〇 5 g K2 HPO4 于 500 ml H2O 中 ，高压灭菌。

用 前 按 I = 1 0 比例用 T B 稀 释 。

Terrific Broth (T B ) 培养基

四环素

Tris 缓冲盐溶液（T B S )

仪器

套 管（butterfly I V 23-gauge blue)

细胞培养瓶

玻璃研磨器

Luria B r o t h 琼脂平皿

摇 床（37°C )

外科手术工具

注射器

方法

噬菌体展示文库的注入

1• 将 选 好 的 噬 菌 体 文 库 溶 于 DMEM 或 PBS, 使 浓 度 达 到 3.3 X 10¹⁰。转导单位(TU) /ml。

2 . 将 l 〇 ¹⁰T U 的噬菌体文库通过尾部静脉注射到受试动物体内。体积不超过 300ul。

3 . 动物存活要超过 3〜5 min, 以便于文库在体内的传播。

经 心 脏 的 灌 注 和 洗 涤

在手术收集目标器官之前必须进行实验动物的经心脏灌注，这样可以降低非特异性背景噬菌体的回收。但是，一 些 器 官（如肾脏）灌注会增加非特异性背景噬菌体的聚集 ，使得实验结果变差。另外，灌注在首轮筛选中不建议使用，因为过度的处理会抵消多肽的结合能力，尤其是当结合的多肽数目不多时。为了减少来源于血液的背景噬菌体的回收量，如果不做灌注的话，小鼠可完’全放血。

4•确定实验动物是在深度麻醉下进行解剖的。

5 .切开表皮至横膈膜，将胸壁和腹壁暴露。

6.开胸骨下面的腹膜，不要破坏肝脏、心脏，以及其他较大的血管。

7•沿着 coastal arch, 从下面切断。

8 . 沿测线切开胸腔，从横膈膜一直到腋窝，注意不要破坏肺。

9.将前面的胸腔壁翻开，露出心脏。用夹子固定住。

10.将与套管的注射器内含有大约 5 ml 室温的 DMEM 注射到左心室。

1 1 . 在右心房切一小口作为血液的出口。

1 2 . 低压灌注以防损坏血管。

总共经心脏灌注 50 ml。 相对的严格性是与所用的体积直接相关的，在首次做筛选时（如果用灌注的话)，可以使用少量的灌注体积。

13.手术获取目标器官和至少一个对照器官（如肺或脑）。立即置于冰上，避免结合的噬菌体内化作用。

14.称量器官的重量，用玻璃的组织研磨器研磨均勻。

15.加 人 Im I 冰冻的加人胰蛋白酶抑制剂的 D M E M 于组织研磨液中，涡旋， 4°C ,3000r/miri 离心 4m i n 。除去上清液。

16.重复步骤 15 (洗 涤 3 次，首次筛选可洗漆一两次)。

17.最后一次离心完毕，除去上清液，将样品保存在冰上直至加人菌液。
K 91 ka n 菌的生长

18•从 K 9U a w 琼脂平皿挑取一 streak 加人到 5m l 添加了 200ug/m l 的卡那霉素和 10%的 T B s u p p l e m e n t 的 T B 培养基。

19.在 37°C ，以通常的转速振荡培养 2〜4 h 。建议在文库注射到动物体内开始培养细菌。

20•将一部分菌液用 T B 按 I : 10 稀释，测 定 OD600。

当 OD600在 0.16〜0 . 2 0 , 降低转速以颤声剪切瓶力。在 30m i n 内使用。细胞颗粒中噬菌体的回收

21•加 1500ul K 9 1 kan 菌液到噬菌体细胞颗粒中，轻轻重悬颗粒，要完全。 37°C 孵育30m i n ，涡 旋 或 上 下 颠 倒 样 品 l O m i n 。

22.将细菌转移到一个 500m l 细胞培养瓶中，添 加 IOOml 预热的含有〇.2 ug /m l 的四环素， 37°C 解育 30 min。

23•从悬浮液中取出 1 〇〜IOOul 于含有 40 ug/m l 的四环素来计算每一个组织中噬菌体的转导单位。

24.调整剩余菌液中四环素的浓度到 20ug/m l ， 37°C 摇床过夜培养。
菌液至少培养 12 h , 但 不能超过 16 h 。从菌液中回收噬菌体

25.将菌液 800 〇 r/m i n 离 心 15m i n ，将上清液倒人一个干净的试管。当倾倒时不要将细胞颗粒倒人试管的上部。

26.每 10 ml上清液加人 1.5ml of PEG/NaCl，振摇，冰上孵育 111。样品也可以 4℃孵育过夜。

27.4°C ， 8000r/m i n 离 心 20m i n , 轻轻倒出上清液。

28.将离心管放入转子中，使含有颗粒的一侧朝向转子的外侧。 8000r/min 离 心 5 min以除去所有的 P E G , 进一步浓缩沉淀。

29.用真空吸样器或 200M 的吸液管将上清液迅速吸出。

30•加 T B S 到噬菌体沉淀中（2 0 0 〜 400M ，主要根据的量）振 摇 l O m i n。避免吸液管吹起泡引起噬菌体沉淀再悬浮而损害噬菌体和被展示的多肽。

3 1 . 将溶液转移到一个 E p p e n d o r f 管， 14 O O O r / m i n 离 心 I O m i n 以除去细菌碎 片 。

32.小心的上清液（噬菌体溶液）转移到一个新的 Eppendorf 管中，注意不要碰到沉淀。

33•滴定回收噬菌体溶液（见方案 2 ) 。

34.重复噬菌体筛选（步 骤 1〜32)，在每一轮的连续筛选中，所用回收的噬菌体的浓度