噬菌体展示技术筛选多肽

噬菌体展示技术筛选多肽

噬菌体肽库的构建多选用基因合成法，步骤类似于噬菌体抗体库的构建：即化学合成编码各种序列某一长度肽的寡核苷酸片段（如构建的肽文库是由6个氨基酸残基组成，就应含有206种不同的氨基酸序列，即约109种不同密码子的组合），然后通过DNA重组方法，插入到表达载体上的外被蛋白基因（如基因III或基因VIII）中，再利用电穿孔技术，将各种重组体转入大肠杆菌细胞中并以融合蛋白的形式表达和显示在噬菌体的表面。

筛选多肽

筛选主要包括：靶分子直接包被塑料平板/平皿（通过非特异的疏水键和静电作用）； 噬菌体蛋白库与包被的靶分子结合；洗去未结合的噬菌体；洗脱获得特异结合的噬菌体并进行滴度测定，亲和力检测和生物功能检测等。以包被60´15mm平皿为例，简述筛选步骤。

影响筛选的因素

1、去污剂 去污剂（特别是Tween-20）可以减少噬菌体和靶蛋白的非特异作用。初始使用较低的Tween浓度会产生较高的洗脱滴度，随后，逐渐增加Tween的浓度使筛选条件越来越严格，最大浓度为0.5%。本实验室在筛选时，始终使用0.5%的浓度或三轮筛选依次递增（0.1，0.3，0.5%）都能获得良好效果。如果预计初始筛选的噬菌体洗脱滴度非常地低的话，要使用较低浓度的Tween。

2、温度 温度对筛选有一定的影响，某些情况下严格筛选需要提高温度，而另一些情况下需降低温度。一般可以试用4℃，室温和37℃。温度升至55℃也不会灭活噬菌体。

3、结合和洗脱时间 严格筛选时，要缩短靶蛋白与噬菌体的结合时间，延长洗脱时间。

4、靶蛋白浓度 如果是以溶液形式进行筛选，靶蛋白的浓度很重要，低浓度有利于严格筛选。

5、筛选轮数 伴随着每一轮的筛选和扩增，能与靶蛋白特异结合的噬菌体得到富集。如果每一轮筛选都采用恒定的噬菌体浓度，则在某一轮时，洗脱下的大部分甚至全部噬菌体都表达一致的结合序列，一般2~3轮筛选即可出现。若未果，需进行第三轮筛选。