材料与仪器
羧苄青霉素 氯霉素 大肠杆菌 CJ236
生理磷酸缓冲液 超纯甘油 PBS-T 缓冲液 PBS-T-BSA 缓冲液
2YT 培养基 SOC 培养基
生理磷酸缓冲液 超纯甘油 PBS-T 缓冲液 PBS-T-BSA 缓冲液
2YT 培养基 SOC 培养基
步骤
下述方法描述了 P8 库的设计（见 12.3.1)、构建（见 12.3.2 )、选择（见 12.3.3.1 ) 和筛选（见 12.3.3.2)，依此来鉴定能改进蛋白质表达水平的突变体。我们描述了利用前述噬菌粒—— pS1607 改进 hGH 表达水平的方案。这一方法也适用于任何其他靶蛋白。唯一的改变就是用表达靶蛋白的噬菌体粒取代 pS1607 以及用高亲和性
的靶蛋白配体取代 hGH 结合蛋白。
3.1 库的设计
我们前面已经提及在噬菌粒表达系统中 P8 的 N 端部分极度耐受突变，其中有些突变能增加异源融合蛋白的展示水平 [ 10，11 ]。随后，我们发现 P8 的 N 端只有 6 个野生型残基侧链（Ala 7、Ala 9、Ala 10、Phe11、Leu14 和 Ala18 ) 对 P8 有效包装到噬菌体外壳是必需的 [ 10，12 ]。这些侧链形成一个紧密的疏水抗原决定簇（图 12.1)，在噬菌体组装过程中起到关键作用。环绕这一决定簇的残基突变能增加包装效率，从而增加异源蛋白
的展示水平 [ 10 ]。基于这些研究，我们鉴定出了 7 个位点（Pro 6、Lys 8、Asn12、Ser13、Gln15、Ala16 和 Ser17)，这些位点的突变最可能改进蛋白质展示水平（图 12.1)。蛋白质内 7 个位点的完全随机化能导致接近 109 的独特氨基酸组合，这一多样性能够被这里所描述的制备库的约 1010 的多样性所覆盖。
3.2 库的构建
P8 变异库用前述寡核苷酸诱导突变法的优化版本 [2] 来构建。首先，一条突变的寡核苷酸（序列：GTAATAATAAGCGACCGAATATATC) 用于在随机化位点引入终止密码子；12.3.2.2 节中提供的寡核苷酸诱导的位点特异的突变方案可以用于小规模突变来引入终止密码子（见注 1 )。终止密码子的引入消除了野生型蛋白的表达，所以 “终止模板” 噬菌粒可以作为模板用来建库。含尿嘧啶的单链 DNA 终止模板（从宿主中纯化的）和突变寡核苷酸（序列：GCCGAGGGTGACGATNNKGCATAAGCGGCCTTTNNKNNKCTGNNKNNKNNKGCGACCGAATATATC ) 进行退火，这样就能用编码 20 种氨基酸的 NNK ( N = A/G/C/T，各 25%；K = G/T，各 50% )
取代终止密码子。突变寡核苷酸链作为引物合成一条互补的 DNA 链，最终形成一个共价闭环双链异质 DNA (CCC-dsDNA)。建库完成后，CCC-dsDNA 通过电转化法引入宿主中，在宿主中错配按照野生序列或突变序列进行修复。在 ung+ 菌株中，dU 模板链倾向于失活，而合成的突变链被增殖，这样就实现了有效突变（大
于 50% )。用随机化位点均为终止密码子的序列做模板保证了只有完全突变的克隆才含有可读框，才能在噬菌体表面展示。与辅助噬菌体一起转化宿主大肠杆菌，库里的各成员就能包装进噬菌体颗粒。
3.2.1 纯化 dU-ssDNA 模板
突变效率依赖模板的纯度，因此高纯度 dU-ssDNA 的应用对库的成功构建至关重要。我们用 Qiagen QIAprep Spin M13 Kit 来纯化 dU-ssDNA，下面就是 Qiagen 方案的一个修改版。对一个中等拷贝的噬菌粒而言（如 PS1607，其包含 pBR322 的骨架），这个方案至少能获得 20 μg 的 dU-ssDNA，这足以满足建库的需要（见注 2)。
( 1 ) 从新鲜的 LB/抗菌素板上挑出一个含有某噬菌粒的 E.coli CJ236 ( 或者其他 dut- / ung- ) 菌株的单克隆放入 1 ml 2YT 加有 M13KO7 helper 噬菌体（1010 pfu/ml ) 和相应抗菌素的培养基中以保持宿主 F' 附加体和噬菌粒。例如，2YT/Carb/cmp 培养基中含有羧苄青霉素来选择带有内酰胺酶基因的噬菌粒，而氯霉素用来选择 CJ236
F' 附加体。37°C 及 200 r/min 下摇动 2 h 并且加入卡那霉素（25 μg/ml ) 来选择被 M13KO7 共转染的带有卡那霉素抗性基因的克隆。在 37°C 及 200 r/min 下摇动 6 h 后，转移培养到 30 ml 的 2YT/carb/kan/uridine 培养基。再在 37°C 及 200 r/min 下摇动过夜。
( 2 ) 在 4°C 27000 g 下（15000 r/min 在 Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min。转移上清液到含有 1/5 体积 PEG/NaCl 的新试管中，室温孵育 5 min。在 4°C 12000 g 下 ( 10000 r/min 在 Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min。移走上清液，在 2000 g ( 4000 r/min) 下短暂离心，吸出残余上清液。
( 3 ) 在 0.5 ml 的 PBS 中重新悬浮起噬菌体沉淀小团，转移到一个新的 EP 离心管中。在桌式小离心机中用 14000 g 离心 5 min，转移上清液到新的 EP 离心管中。
( 4 ) 加入 7.0 μl MP 缓冲液（Qiagen) ，混匀。室温孵育至少 2 min。
( 5 ) 在 2 ml 小离心试管的 QIAprep spin column（离心层析柱，Qiagen）中加入上述样品。在桌式小离心机中 6000 g 离心 30s。遗弃流出液。噬菌体颗粒仍然结合在层析柱介质中。
( 6 ) 在柱中加入 0.7 ml 的 MLB 缓冲液（Qiagen)。6000 g 离心 30s，弃流出液。
( 7 ) 在柱中再加入 0.7 ml 的 MLB 缓冲液。室温孵育至少 1 min。6000 g 离心 30s。弃流出液。噬菌体 DNA 与壳蛋白分离，仍然吸附在层析柱介质中。
( 8 ) 加入 0.7 ml 的 PE 缓冲液（Qiagen)。6000 g 离心 30s，弃流出液。
( 9 ) 重复步骤（8 )，去除残余的蛋白质及盐。
( 10 ) 6000 g 离心 30s，将小层析柱转移到一个新的 1.5 ml EP 离心试管中。
( 11 ) 加入 100 μl 的 EB 缓冲液（Qiagen: 10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5 ) 到层析柱膜的中心部位。室温孵育 10 min，然后 6000 g 离心 30s。保存流出液，其中包含纯化的 dU-ssDNA。
( 12 ) 分析上述 DNA，用 1.0 μl DNA 溶液进行 TAE 琼脂糖凝胶电泳。结果 DNA 应该是明显的单一条带，但是也经常可以观察到一些较低电泳迁移率的弱带（见图 12.2 中泳道 2 )。这些弱带很可能是由于 ssDNA 的二级结构所致。
( 13 ) 利用 260 nm 的吸收值（A260 = 1.0 相应于 33 ng/μl 单链 DNA ) 测定 DNA 浓度。典型 DNA 浓度范围应该为 200~500 ng/μl。
3.2.2 体外合成异源双链 CCC-dsDNA
用 dU-ssDNA 作为模板，经过三步程序就能把突变寡核苷酸包装到异源 CCC-dsDNA 内。这里描述的方案是前述方法的改进和规模扩大化的版本 [13] 。寡核苷酸先进行 5' 磷酸化，然后和 dU-ssDNA 模板退火。寡核苷酸链通过延伸和连接形成异源 CCC-dsDNA ( 图 12.2 中泳道 3 )，然后再进行纯化和脱盐。这一方案能获得大约 20 μg 高纯度、低电导率的 CCC-dsDNA。这足以构建容量超过 1010 的库（见注 3)。
1 ) 用 T4 多聚核苷酸激酶磷酸化寡核苷酸
( 1 ) 在 1.5 ml EP 离心管中混合加入 0.6 μg 突变寡核苷酸、2.0 μl 的 10X TM 缓冲液、2.0 μl 的 10 mmol/L ATP 和 1.0 μl 的 100 mmol/L DTT。加水到总体积为 20 μl。
( 2 ) 往上述体系中加入 20U 的 T4 聚核苷酸激酶。37°C 孵育 1 h (见注4)。
2 ) 寡核苷酸和模板一起退火
( 1 ) 在 20 μl 磷酸化反应混合物中加入 20 μg 的 dU-ssDNA 模板（来自 12.3.2.1 ) 、25 μl 的 10 X TM 缓冲液，加水到总体积为 250 μl。假设寡核苷酸与模板长度比是 1:100，上述 DNA 的量给出寡核苷酸与模板摩尔比为 3:1。
( 2 ) 90°C 孵育 3 min、50°C 孵育 3 min、20°C 孵育 5 min ( 见注 5)。
3 ) 合成 CCC-dsDNA
( 1 ) 在已经退火的寡核苷酸与模板混合物中加入 10 μl 10 mmol/L ATP、10 μl 25 mmol/L 的 dNTP、15 μl 100 mmol/L DTT、30 Weiss U 的 T4 DNA 连接酶以及 30U 的 T7 DNA 聚合酶。
( 2 ) 20°C 孵育过夜。
( 3 ) 利用 Qiagen QIAquick DNA 纯化试剂盒，对上述 DNA 进行亲和纯化及脱盐。加入 1.0 ml 的 QG (Qiagen) 缓冲液混合。
( 4 ) 将上述样品放入两个置于 2 ml 离心试管中的 QIAquick spin 离心层析柱。在桌式小离心机中用 14000 g 离 心 1 min，去除流过液。
( 5 ) 在每个柱子中加入 750 μl 的 PE 缓冲液（Qiagen)。14000 g 离心 1 min。去除流过液，再 13000 r/min 离 心 1 min。将层析柱置于新的 1.5 ml EP 小离心管。
( 6 ) 在层析柱膜的中心部位加入 35 μl 的 USP 超纯水。室温孵育 2 min ( 见注 6)。
( 7 ) 14000 g 离心 1 min 洗提出 DNA。混合两个管中的洗提液。得到的 DNA 可以立即进行大肠杆菌电转化实验，也可冻存以备后用。
( 8 ) 同时与 dU-ssDNA 模板电泳 1.0 μl 的上述洗提出的反应产物。用含有溴化乙锭（EB ) 的 TAE 琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA ( 图 12.2 及注 7 )。
一个成功的反应能使 dU-ssDNA 完全转化成低电泳迁移率的 dsDNA。通常，至少能看到两条产物带并且不存在dU-ssDNA ( 图 12.2) 。 其中电泳迁移率较高的带就是所需的产物——正确延伸和连接的 CCC-dsDNA，可以用于有效转化大肠杆菌并且提供较高突变效率（约 80% )。而电迁移率较低的带是由 T7 DNA 聚合酶星号活性所致的单链异常产物 [14]，其突变率较低（约 20% )，转化效率也只有 CCC-dsDNA 的 1/30。如果 ssDNA 模板的重要部分转化为 CCC-dsDNA，那么就能得到一个高突变、高多样性的库。有时能得到电迁移率介于前述二者之间的第 3 条带，这条带被正确延伸但是没有连接的 dsDNA ( 图 12.2) 。产生这一条带的原因要么是 T4 DNA 连接酶活性不够，要么就是寡核苷酸磷酸化不完全。
3.2.3 大肠杆菌电穿孔和噬菌体扩增
要完成库构建，异源 CCC-dsDNA 还必须引入含有 F' 附加体的大肠杆菌宿主中。M13 噬菌体能侵染这种宿主并在其中增殖。噬菌体展示库的多样性还受限于 DNA 引入大肠杆菌的方法，其中高压电转化法的效率最高。
我们构建了一个大肠杆菌菌株——SS320，这是高效电转化和噬菌体增殖的理想菌株 [2]。用标准的噬菌体杂交方案 [ 15 ]，我们将 F' 附加体从 E.coli XL-1 Blue (Stmtagene) 转入 E.coli MC1061 (Bio-Rad)。E.coli MC1061 的染色体标记有链霉素抗性，而 E.coli XL-1 Blue 的附加体含有四环素抗性，这样杂交产生的子代菌株可以通过链霉素和四环素双抗进行选择。E.coli SS320 保留了 E.coli MC1061 的高电转化效率，同时 F' 附加体的存在使得 M13 噬菌体感染宿主成为可能。
( 1 ) 将上述纯化好的 DNA ( 来自 3 )，约 20 μg 置于最小体积）及 0.2 cm 间隙的电转槽置于冰上冷却。在冰上融化 350 μl 分装好的电转感受态 E.coli SS320 细胞。将感受态细胞加入 DNA 中且用移液枪吸放数次混合（避免产生气泡）。
( 2 ) 转移混合物于电转槽中进行电穿孔转化。电穿孔转化操作时，应遵循仪器厂家的指导手册，建议使用 BTX ECM-600 电转化仪时应设置：场强 2.5kV，电阻 129Ω，电容 50 μF。也可以使用 BioRad 的 Gene Pulser 电转化仪及如下设置：场强 2.5kV，电阻 200 Ω，电容 25 μF。
( 3 ) 立即在电穿孔转化后的电转槽中加入 1 ml SOC 培养基以营救这些细胞并且转移培养基到一个 250 ml 的锥形瓶中。用 1 ml SOC 培养基冲洗电转槽两次。再向瓶中加入 SOC 培养基到终体积为 25 ml，在 200 r/min 摇 床 37°C 孵育 20 min。
( 4 ) 要确定所建库的多样性，可以在 LB/carb 培养皿中系列稀释涂板来选择适当的噬菌粒（如带有 β-内酰胺酶基因的噬菌粒 pS1607)。
( 5 ) 加入 M13KO7 helper 噬菌体（4 X 1010 pfu/ml)，在 200 r/min 摇床 37°C 孵育 10 min。
( 6 ) 转移培养液于含有 500 ml 2YT 培养基的 2 L 锥形瓶中，加入合适的抗生素进行噬菌粒选择（如 2YT/carb 培养基）。
( 7 ) 在 200 r/min 摇床 37°C 孵育 1 h 且加入 25 μg/ml 的卡那霉素。然后在 200 r/min 摇动下 37°C 孵育过夜。
( 8 ) 将上述培养液在 4°C 及 16000 g 下（10000 r/min 在 Sorvall GSA 转子中）离心 10 min。转移上清液到含有 1/5 体积 PEG/NaCl 的新试管中以沉淀噬菌体。室温孵育 5 min。
( 9 ) 在 Sotvall GSA 转子中 4°C 及 16000 g 下离心 10 min。去除上清液。再简短离心一下，用移液管吸走上清液残余。重新悬浮噬菌体小团于 1/20 体积的 PBS 中。
( 10 ) 在 4°C 及 27000 g 下（在 Sorvall SS-34 转子中，15000 r/min) 离心 5 min 以去除不溶性杂质。转移上清液于一个干净试管。
( 11 ) 利用分光光度计估计噬菌体浓度（268 nm 的光密度 [OD268] = 1.0 时溶液中噬菌体浓度约为 5 X 1012 噬菌体/ml；见注 8）。
3.2.4 制备 E.coli SS320 电穿孔法感受态
下述方案能产生大约 12 ml 高浓度 E.coli SS320 电穿孔法感受态（约 3 X 1011 cfn/ml )。细胞可以长期储存于 -70°C。
( 1 ) 在 1 ml 的 2YT/tet 培养基中接种一个生长于新鲜 LB/tet 培养皿的 E.coli SS320 菌株单克隆。在 200 r/min 摇床 37°C 孵育 6~8 h。
( 2 ) 转移培养液于有 500 ml 的 2YT/tet 培养基的 2 L 锥形瓶中，在 200 r/min 摇动下 37°C 孵育过夜。
( 3 ) 用 5 ml 上述过夜培养液接种 6 个 2 L 锥形瓶，每瓶含有 900 ml 的 Superbroth/tet 培养基（见 12.2.1.4)。在 200 r/min 摇动下 37°C 孵育到 OD550 约为 0.8。
( 4 ) 在冰上冷却 3 个上述锥形瓶 5 min，不时摇动。下列步骤（5 )~（12 ) 应该在冷室中及冰上进行，所用一切溶液及仪器应该预冷。
( 5 ) 在 Sorvall GS-3 转子中 4°C 及 5000 g ( 5500 r/min) 下离心 10 min。去除上清液然后从其他 3 个瓶中加入余下的培养液（所有液体需要预冷）。重复上述离心及去除上清液步骤。
( 6 ) 在离心瓶中加入 1.0 mmol/L HEPES，pH 7.4，同时加入灭菌的磁铁搅拌棒来帮助重悬离心沉淀的细胞。摇动使沉淀脱离管壁，并且在适中的速度下磁力搅拌以完全重悬细胞沉淀。
( 7 ) 在 Sorvall GS-3 转子中 4°C 及 5000 g ( 5500 r/min) 下离心 10 min。去除上清液，小心管中的磁铁搅拌棒。从转子中取出离心管时要小心保持离心管的位置以避免干扰管底的细胞沉淀。
( 8 ) 在离心瓶中加入 1.0 mmol/L HEPES，pH 7.4。重悬细胞沉淀，重复步骤（6 ) 和（7 ) 中的重悬及离心过程。去除上清液。
( 9 ) 重悬每管细胞沉淀于 150 ml 的 10% 超纯甘油中。不要混合各离心管。
( 10 ) 在 Sorvall GS-3 转子中 4°C 及 5000 g ( 5500 r/min) 下离心 15 min。去除上清液并且取出磁铁搅拌棒。用一个移液管小心吸出残余的上清液。
( 11 ) 在一个离心管中加入 3.0 ml 的 10% 超纯甘油，用（移液管）小心抽吸重悬细胞沉淀。转移悬浮好的细胞到另一个离心管，重复上述过程直到所有细胞沉淀都得到很好地悬浮。
( 12 ) 在液氮中快速冰冻分装为 350 μl 的感受态细胞并且储存于 -70°C。
3.3 选择和分析能提高融合蛋白展示水平的 P8 变异体
3.3.1 从 hGH-P8 库中选择噬菌体
将 hGHbp 包被于 96 孔 Maxisorp 免疫板上作为诱饵，上述 hGH-P8 库中的噬菌体通过多轮结合实验进行筛选 [16]。在 M13KO7 辅助噬菌体的帮助下，噬菌体在 XL-1 Blue 中进行增殖以备后续筛选之用。
1 ) 用靶蛋白包被 96 孔 Maxisorp 板
( 1 ) 用 100 μl 5 μg/ml 的靶蛋白（如 hGHbp) 溶液包被 96 孔 Maxisorp 板中的 8 孔，4°C 孵育过夜。直接倾倒 96 孔板于水池，以去除孔中溶液。
( 2 ) 在每孔中加入 200 μl 0.2% 溶于 PBS 的 BSA 溶液以阻止其他蛋白质对 Maxisorp 板的非特异性结合，室温下摇动 1 h。
2 ) 噬菌体库的选择
( 1 ) 在上述每孔中加入一定量的置于 PBS-T-BSA 缓冲液中的噬菌体库（约 1012 phage/ml)。在室温下摇动 2 h 。然后用 PBS-T 缓冲液洗 96 孔 Maxisorp 板 8 次。结合筛选的严厉性（stringency) 可以在以后的筛选中通过增加洗涤的次数来调控。
( 2 ) 在每孔中加入 100 μl 的 100 mmol/L HCl 以洗脱结合的噬菌体。在室温下强力摇动 5 min。
( 3 ) 将所有洗脱液收集到一起，加入 1/5 体积的 1.0 mol/L Tris-碱中和。
3 ) 增殖噬菌体以备后用
( 1 ) 将上述洗脱出的噬菌体混合液加入到 10 倍体积的 XL-1 Blue 细胞中（OD550 =0.5~1.0 ) 。
( 2 ) 37℃ 下 200 r/min 摇动孵育 20 min，取出 10 μl 留备测量滴度，参考 12.3.2.3 节中步骤（4 ) 。
( 3 ) 加入 M13KO7 helper 噬菌体，在 200 r/min 摇床 37°C 孵育 45 min。
( 4 ) 转移培养液于 100 ml 的 2YT/carb/kan 培养基中，在 200 r/min，37°C 下摇动过夜。
( 5 ) 利用 PEG/NaCl 沉淀法分离噬菌体，参照 12.3.2.3 节，步骤（8 ) ~（10)。
( 6 ) 重复上述筛选过程 5 次，每轮只用一半的洗脱噬菌体。
3.3.2 噬菌体酶联免疫法测定 hGH 展示水平
在 hGH 展示选择后（见 12.3.3.1)，通过酶联免疫法 [ 2，11 ] 可以测定单个克隆的 hGH 相对于 P8 的展示水平。顺次稀释的 hGH- P8 噬菌体溶液在含固定化 hGHbp 诱饵的板上孵育。洗去未结合的噬菌体，结合的噬菌体经过辣根过氧化物酶偶联的 M13 抗体反应后可以通过光谱学进行检测。从噬菌体浓度对 450 nm 吸收值曲线上，通过比较噬菌体浓度和特定吸收值关系，可以估计出 P8 变异体较野生型 P8 对 hGH 展示水平提高的程度 [11] 。hGH 展示水平高的克隆被送去测定其 DNA 序列，进而推断出融合有 hGH 的 P8 变异体的序列。
( 1 ) 从新鲜的 LB/tet 板上挑出一个含有特定噬菌粒的 E.coli XL-1 Blue 菌株的单克隆，放入 1 ml 加有 M13KO7 helper 噬菌体（1010 pfu/ml ) 和 50 μg/ml 羧苄青霉素（以保持噬菌体）及 5 μg/ml 四环素（以保持 F' 附加体）的 2YT 培养基中。在 200 r/min，37°C 下摇动 2 h，再加入 25 μg/ml 的卡那霉素来选择共转染了 M13KO7 的克隆。再在 200 r/min，37°C 下摇动 6 h，转移培养液于 30 ml 2YT/carb/kan 培养基中。在 200 r/min，37°C 下摇动过夜。
( 2 ) 在 4°C 及 27000 g 下（Sorvall SS-34 转子中，15000 r/min) 离心 10 min。转移上清液于一个含有 1/5 体 积 PEG/NaCl 的干净试管中，室温孵育 5 min。在 4°C 及 12000 g 下（10000 r/min，Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min。去除上清液。在 2000 g ( 4000 r/min) 简短离心一下，再用移液管吸走上清液残余。
( 3 ) 重悬噬菌体沉淀小团于 0.5 ml 的 PBS-T-BSA 缓冲液中，将其转移到一个 1.5 ml 的 EP 离心管中。在桌式离心机中用 14000 g 离心 5 min，再转移上清液到一个新的 1.5 ml EP 离心管中。
( 4 ) 利用分光光度计法估计噬菌体浓度。
( 5 ) 用 PBS-T-BSA 缓冲液准备 5 倍系列稀释的噬菌体储液。
( 6 ) 转移 100 μl 的噬菌体溶液到有 hGHbp 包被且 BSA 封闭的 96 孔 Maxisorp 免疫板（见 12.3.3.1 中 1))。温和摇动孵育 1 h。
( 7 ) 去除噬菌体溶液，用 PBS-T 缓冲液洗板 8 次。
( 8 ) 加入 100 μl 的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase) / 抗M13 抗体络合物 ( 用 PBS-T- BSA 缓冲液稀释3000 倍，见 12.2.2.2)。温和摇动孵育 30 min。
( 9 ) 用 PBS-T 缓冲液洗 8 次，再用 PBS 洗 2 次。
( 10 ) 用 100 μl 的 TMB 底物溶液显影 96 孔免疫板。用 100 μl 的 1.0 mol/L H3PO4 溶液终止反应，然后在 96 孔板读板仪中读出 450 nm 的光吸收值。
的靶蛋白配体取代 hGH 结合蛋白。
3.1 库的设计
我们前面已经提及在噬菌粒表达系统中 P8 的 N 端部分极度耐受突变，其中有些突变能增加异源融合蛋白的展示水平 [ 10，11 ]。随后，我们发现 P8 的 N 端只有 6 个野生型残基侧链（Ala 7、Ala 9、Ala 10、Phe11、Leu14 和 Ala18 ) 对 P8 有效包装到噬菌体外壳是必需的 [ 10，12 ]。这些侧链形成一个紧密的疏水抗原决定簇（图 12.1)，在噬菌体组装过程中起到关键作用。环绕这一决定簇的残基突变能增加包装效率，从而增加异源蛋白
的展示水平 [ 10 ]。基于这些研究，我们鉴定出了 7 个位点（Pro 6、Lys 8、Asn12、Ser13、Gln15、Ala16 和 Ser17)，这些位点的突变最可能改进蛋白质展示水平（图 12.1)。蛋白质内 7 个位点的完全随机化能导致接近 109 的独特氨基酸组合，这一多样性能够被这里所描述的制备库的约 1010 的多样性所覆盖。
3.2 库的构建
P8 变异库用前述寡核苷酸诱导突变法的优化版本 [2] 来构建。首先，一条突变的寡核苷酸（序列：GTAATAATAAGCGACCGAATATATC) 用于在随机化位点引入终止密码子；12.3.2.2 节中提供的寡核苷酸诱导的位点特异的突变方案可以用于小规模突变来引入终止密码子（见注 1 )。终止密码子的引入消除了野生型蛋白的表达，所以 “终止模板” 噬菌粒可以作为模板用来建库。含尿嘧啶的单链 DNA 终止模板（从宿主中纯化的）和突变寡核苷酸（序列：GCCGAGGGTGACGATNNKGCATAAGCGGCCTTTNNKNNKCTGNNKNNKNNKGCGACCGAATATATC ) 进行退火，这样就能用编码 20 种氨基酸的 NNK ( N = A/G/C/T，各 25%；K = G/T，各 50% )
取代终止密码子。突变寡核苷酸链作为引物合成一条互补的 DNA 链，最终形成一个共价闭环双链异质 DNA (CCC-dsDNA)。建库完成后，CCC-dsDNA 通过电转化法引入宿主中，在宿主中错配按照野生序列或突变序列进行修复。在 ung+ 菌株中，dU 模板链倾向于失活，而合成的突变链被增殖，这样就实现了有效突变（大
于 50% )。用随机化位点均为终止密码子的序列做模板保证了只有完全突变的克隆才含有可读框，才能在噬菌体表面展示。与辅助噬菌体一起转化宿主大肠杆菌，库里的各成员就能包装进噬菌体颗粒。
3.2.1 纯化 dU-ssDNA 模板
突变效率依赖模板的纯度，因此高纯度 dU-ssDNA 的应用对库的成功构建至关重要。我们用 Qiagen QIAprep Spin M13 Kit 来纯化 dU-ssDNA，下面就是 Qiagen 方案的一个修改版。对一个中等拷贝的噬菌粒而言（如 PS1607，其包含 pBR322 的骨架），这个方案至少能获得 20 μg 的 dU-ssDNA，这足以满足建库的需要（见注 2)。
( 1 ) 从新鲜的 LB/抗菌素板上挑出一个含有某噬菌粒的 E.coli CJ236 ( 或者其他 dut- / ung- ) 菌株的单克隆放入 1 ml 2YT 加有 M13KO7 helper 噬菌体（1010 pfu/ml ) 和相应抗菌素的培养基中以保持宿主 F' 附加体和噬菌粒。例如，2YT/Carb/cmp 培养基中含有羧苄青霉素来选择带有内酰胺酶基因的噬菌粒，而氯霉素用来选择 CJ236
F' 附加体。37°C 及 200 r/min 下摇动 2 h 并且加入卡那霉素（25 μg/ml ) 来选择被 M13KO7 共转染的带有卡那霉素抗性基因的克隆。在 37°C 及 200 r/min 下摇动 6 h 后，转移培养到 30 ml 的 2YT/carb/kan/uridine 培养基。再在 37°C 及 200 r/min 下摇动过夜。
( 2 ) 在 4°C 27000 g 下（15000 r/min 在 Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min。转移上清液到含有 1/5 体积 PEG/NaCl 的新试管中，室温孵育 5 min。在 4°C 12000 g 下 ( 10000 r/min 在 Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min。移走上清液，在 2000 g ( 4000 r/min) 下短暂离心，吸出残余上清液。
( 3 ) 在 0.5 ml 的 PBS 中重新悬浮起噬菌体沉淀小团，转移到一个新的 EP 离心管中。在桌式小离心机中用 14000 g 离心 5 min，转移上清液到新的 EP 离心管中。
( 4 ) 加入 7.0 μl MP 缓冲液（Qiagen) ，混匀。室温孵育至少 2 min。
( 5 ) 在 2 ml 小离心试管的 QIAprep spin column（离心层析柱，Qiagen）中加入上述样品。在桌式小离心机中 6000 g 离心 30s。遗弃流出液。噬菌体颗粒仍然结合在层析柱介质中。
( 6 ) 在柱中加入 0.7 ml 的 MLB 缓冲液（Qiagen)。6000 g 离心 30s，弃流出液。
( 7 ) 在柱中再加入 0.7 ml 的 MLB 缓冲液。室温孵育至少 1 min。6000 g 离心 30s。弃流出液。噬菌体 DNA 与壳蛋白分离，仍然吸附在层析柱介质中。
( 8 ) 加入 0.7 ml 的 PE 缓冲液（Qiagen)。6000 g 离心 30s，弃流出液。
( 9 ) 重复步骤（8 )，去除残余的蛋白质及盐。
( 10 ) 6000 g 离心 30s，将小层析柱转移到一个新的 1.5 ml EP 离心试管中。
( 11 ) 加入 100 μl 的 EB 缓冲液（Qiagen: 10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5 ) 到层析柱膜的中心部位。室温孵育 10 min，然后 6000 g 离心 30s。保存流出液，其中包含纯化的 dU-ssDNA。
( 12 ) 分析上述 DNA，用 1.0 μl DNA 溶液进行 TAE 琼脂糖凝胶电泳。结果 DNA 应该是明显的单一条带，但是也经常可以观察到一些较低电泳迁移率的弱带（见图 12.2 中泳道 2 )。这些弱带很可能是由于 ssDNA 的二级结构所致。
( 13 ) 利用 260 nm 的吸收值（A260 = 1.0 相应于 33 ng/μl 单链 DNA ) 测定 DNA 浓度。典型 DNA 浓度范围应该为 200~500 ng/μl。
3.2.2 体外合成异源双链 CCC-dsDNA
用 dU-ssDNA 作为模板，经过三步程序就能把突变寡核苷酸包装到异源 CCC-dsDNA 内。这里描述的方案是前述方法的改进和规模扩大化的版本 [13] 。寡核苷酸先进行 5' 磷酸化，然后和 dU-ssDNA 模板退火。寡核苷酸链通过延伸和连接形成异源 CCC-dsDNA ( 图 12.2 中泳道 3 )，然后再进行纯化和脱盐。这一方案能获得大约 20 μg 高纯度、低电导率的 CCC-dsDNA。这足以构建容量超过 1010 的库（见注 3)。
1 ) 用 T4 多聚核苷酸激酶磷酸化寡核苷酸
( 1 ) 在 1.5 ml EP 离心管中混合加入 0.6 μg 突变寡核苷酸、2.0 μl 的 10X TM 缓冲液、2.0 μl 的 10 mmol/L ATP 和 1.0 μl 的 100 mmol/L DTT。加水到总体积为 20 μl。
( 2 ) 往上述体系中加入 20U 的 T4 聚核苷酸激酶。37°C 孵育 1 h (见注4)。
2 ) 寡核苷酸和模板一起退火
( 1 ) 在 20 μl 磷酸化反应混合物中加入 20 μg 的 dU-ssDNA 模板（来自 12.3.2.1 ) 、25 μl 的 10 X TM 缓冲液，加水到总体积为 250 μl。假设寡核苷酸与模板长度比是 1:100，上述 DNA 的量给出寡核苷酸与模板摩尔比为 3:1。
( 2 ) 90°C 孵育 3 min、50°C 孵育 3 min、20°C 孵育 5 min ( 见注 5)。
3 ) 合成 CCC-dsDNA
( 1 ) 在已经退火的寡核苷酸与模板混合物中加入 10 μl 10 mmol/L ATP、10 μl 25 mmol/L 的 dNTP、15 μl 100 mmol/L DTT、30 Weiss U 的 T4 DNA 连接酶以及 30U 的 T7 DNA 聚合酶。
( 2 ) 20°C 孵育过夜。
( 3 ) 利用 Qiagen QIAquick DNA 纯化试剂盒，对上述 DNA 进行亲和纯化及脱盐。加入 1.0 ml 的 QG (Qiagen) 缓冲液混合。
( 4 ) 将上述样品放入两个置于 2 ml 离心试管中的 QIAquick spin 离心层析柱。在桌式小离心机中用 14000 g 离 心 1 min，去除流过液。
( 5 ) 在每个柱子中加入 750 μl 的 PE 缓冲液（Qiagen)。14000 g 离心 1 min。去除流过液，再 13000 r/min 离 心 1 min。将层析柱置于新的 1.5 ml EP 小离心管。
( 6 ) 在层析柱膜的中心部位加入 35 μl 的 USP 超纯水。室温孵育 2 min ( 见注 6)。
( 7 ) 14000 g 离心 1 min 洗提出 DNA。混合两个管中的洗提液。得到的 DNA 可以立即进行大肠杆菌电转化实验，也可冻存以备后用。
( 8 ) 同时与 dU-ssDNA 模板电泳 1.0 μl 的上述洗提出的反应产物。用含有溴化乙锭（EB ) 的 TAE 琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA ( 图 12.2 及注 7 )。
一个成功的反应能使 dU-ssDNA 完全转化成低电泳迁移率的 dsDNA。通常，至少能看到两条产物带并且不存在dU-ssDNA ( 图 12.2) 。 其中电泳迁移率较高的带就是所需的产物——正确延伸和连接的 CCC-dsDNA，可以用于有效转化大肠杆菌并且提供较高突变效率（约 80% )。而电迁移率较低的带是由 T7 DNA 聚合酶星号活性所致的单链异常产物 [14]，其突变率较低（约 20% )，转化效率也只有 CCC-dsDNA 的 1/30。如果 ssDNA 模板的重要部分转化为 CCC-dsDNA，那么就能得到一个高突变、高多样性的库。有时能得到电迁移率介于前述二者之间的第 3 条带，这条带被正确延伸但是没有连接的 dsDNA ( 图 12.2) 。产生这一条带的原因要么是 T4 DNA 连接酶活性不够，要么就是寡核苷酸磷酸化不完全。
3.2.3 大肠杆菌电穿孔和噬菌体扩增
要完成库构建，异源 CCC-dsDNA 还必须引入含有 F' 附加体的大肠杆菌宿主中。M13 噬菌体能侵染这种宿主并在其中增殖。噬菌体展示库的多样性还受限于 DNA 引入大肠杆菌的方法，其中高压电转化法的效率最高。
我们构建了一个大肠杆菌菌株——SS320，这是高效电转化和噬菌体增殖的理想菌株 [2]。用标准的噬菌体杂交方案 [ 15 ]，我们将 F' 附加体从 E.coli XL-1 Blue (Stmtagene) 转入 E.coli MC1061 (Bio-Rad)。E.coli MC1061 的染色体标记有链霉素抗性，而 E.coli XL-1 Blue 的附加体含有四环素抗性，这样杂交产生的子代菌株可以通过链霉素和四环素双抗进行选择。E.coli SS320 保留了 E.coli MC1061 的高电转化效率，同时 F' 附加体的存在使得 M13 噬菌体感染宿主成为可能。
( 1 ) 将上述纯化好的 DNA ( 来自 3 )，约 20 μg 置于最小体积）及 0.2 cm 间隙的电转槽置于冰上冷却。在冰上融化 350 μl 分装好的电转感受态 E.coli SS320 细胞。将感受态细胞加入 DNA 中且用移液枪吸放数次混合（避免产生气泡）。
( 2 ) 转移混合物于电转槽中进行电穿孔转化。电穿孔转化操作时，应遵循仪器厂家的指导手册，建议使用 BTX ECM-600 电转化仪时应设置：场强 2.5kV，电阻 129Ω，电容 50 μF。也可以使用 BioRad 的 Gene Pulser 电转化仪及如下设置：场强 2.5kV，电阻 200 Ω，电容 25 μF。
( 3 ) 立即在电穿孔转化后的电转槽中加入 1 ml SOC 培养基以营救这些细胞并且转移培养基到一个 250 ml 的锥形瓶中。用 1 ml SOC 培养基冲洗电转槽两次。再向瓶中加入 SOC 培养基到终体积为 25 ml，在 200 r/min 摇 床 37°C 孵育 20 min。
( 4 ) 要确定所建库的多样性，可以在 LB/carb 培养皿中系列稀释涂板来选择适当的噬菌粒（如带有 β-内酰胺酶基因的噬菌粒 pS1607)。
( 5 ) 加入 M13KO7 helper 噬菌体（4 X 1010 pfu/ml)，在 200 r/min 摇床 37°C 孵育 10 min。
( 6 ) 转移培养液于含有 500 ml 2YT 培养基的 2 L 锥形瓶中，加入合适的抗生素进行噬菌粒选择（如 2YT/carb 培养基）。
( 7 ) 在 200 r/min 摇床 37°C 孵育 1 h 且加入 25 μg/ml 的卡那霉素。然后在 200 r/min 摇动下 37°C 孵育过夜。
( 8 ) 将上述培养液在 4°C 及 16000 g 下（10000 r/min 在 Sorvall GSA 转子中）离心 10 min。转移上清液到含有 1/5 体积 PEG/NaCl 的新试管中以沉淀噬菌体。室温孵育 5 min。
( 9 ) 在 Sotvall GSA 转子中 4°C 及 16000 g 下离心 10 min。去除上清液。再简短离心一下，用移液管吸走上清液残余。重新悬浮噬菌体小团于 1/20 体积的 PBS 中。
( 10 ) 在 4°C 及 27000 g 下（在 Sorvall SS-34 转子中，15000 r/min) 离心 5 min 以去除不溶性杂质。转移上清液于一个干净试管。
( 11 ) 利用分光光度计估计噬菌体浓度（268 nm 的光密度 [OD268] = 1.0 时溶液中噬菌体浓度约为 5 X 1012 噬菌体/ml；见注 8）。
3.2.4 制备 E.coli SS320 电穿孔法感受态
下述方案能产生大约 12 ml 高浓度 E.coli SS320 电穿孔法感受态（约 3 X 1011 cfn/ml )。细胞可以长期储存于 -70°C。
( 1 ) 在 1 ml 的 2YT/tet 培养基中接种一个生长于新鲜 LB/tet 培养皿的 E.coli SS320 菌株单克隆。在 200 r/min 摇床 37°C 孵育 6~8 h。
( 2 ) 转移培养液于有 500 ml 的 2YT/tet 培养基的 2 L 锥形瓶中，在 200 r/min 摇动下 37°C 孵育过夜。
( 3 ) 用 5 ml 上述过夜培养液接种 6 个 2 L 锥形瓶，每瓶含有 900 ml 的 Superbroth/tet 培养基（见 12.2.1.4)。在 200 r/min 摇动下 37°C 孵育到 OD550 约为 0.8。
( 4 ) 在冰上冷却 3 个上述锥形瓶 5 min，不时摇动。下列步骤（5 )~（12 ) 应该在冷室中及冰上进行，所用一切溶液及仪器应该预冷。
( 5 ) 在 Sorvall GS-3 转子中 4°C 及 5000 g ( 5500 r/min) 下离心 10 min。去除上清液然后从其他 3 个瓶中加入余下的培养液（所有液体需要预冷）。重复上述离心及去除上清液步骤。
( 6 ) 在离心瓶中加入 1.0 mmol/L HEPES，pH 7.4，同时加入灭菌的磁铁搅拌棒来帮助重悬离心沉淀的细胞。摇动使沉淀脱离管壁，并且在适中的速度下磁力搅拌以完全重悬细胞沉淀。
( 7 ) 在 Sorvall GS-3 转子中 4°C 及 5000 g ( 5500 r/min) 下离心 10 min。去除上清液，小心管中的磁铁搅拌棒。从转子中取出离心管时要小心保持离心管的位置以避免干扰管底的细胞沉淀。
( 8 ) 在离心瓶中加入 1.0 mmol/L HEPES，pH 7.4。重悬细胞沉淀，重复步骤（6 ) 和（7 ) 中的重悬及离心过程。去除上清液。
( 9 ) 重悬每管细胞沉淀于 150 ml 的 10% 超纯甘油中。不要混合各离心管。
( 10 ) 在 Sorvall GS-3 转子中 4°C 及 5000 g ( 5500 r/min) 下离心 15 min。去除上清液并且取出磁铁搅拌棒。用一个移液管小心吸出残余的上清液。
( 11 ) 在一个离心管中加入 3.0 ml 的 10% 超纯甘油，用（移液管）小心抽吸重悬细胞沉淀。转移悬浮好的细胞到另一个离心管，重复上述过程直到所有细胞沉淀都得到很好地悬浮。
( 12 ) 在液氮中快速冰冻分装为 350 μl 的感受态细胞并且储存于 -70°C。
3.3 选择和分析能提高融合蛋白展示水平的 P8 变异体
3.3.1 从 hGH-P8 库中选择噬菌体
将 hGHbp 包被于 96 孔 Maxisorp 免疫板上作为诱饵，上述 hGH-P8 库中的噬菌体通过多轮结合实验进行筛选 [16]。在 M13KO7 辅助噬菌体的帮助下，噬菌体在 XL-1 Blue 中进行增殖以备后续筛选之用。
1 ) 用靶蛋白包被 96 孔 Maxisorp 板
( 1 ) 用 100 μl 5 μg/ml 的靶蛋白（如 hGHbp) 溶液包被 96 孔 Maxisorp 板中的 8 孔，4°C 孵育过夜。直接倾倒 96 孔板于水池，以去除孔中溶液。
( 2 ) 在每孔中加入 200 μl 0.2% 溶于 PBS 的 BSA 溶液以阻止其他蛋白质对 Maxisorp 板的非特异性结合，室温下摇动 1 h。
2 ) 噬菌体库的选择
( 1 ) 在上述每孔中加入一定量的置于 PBS-T-BSA 缓冲液中的噬菌体库（约 1012 phage/ml)。在室温下摇动 2 h 。然后用 PBS-T 缓冲液洗 96 孔 Maxisorp 板 8 次。结合筛选的严厉性（stringency) 可以在以后的筛选中通过增加洗涤的次数来调控。
( 2 ) 在每孔中加入 100 μl 的 100 mmol/L HCl 以洗脱结合的噬菌体。在室温下强力摇动 5 min。
( 3 ) 将所有洗脱液收集到一起，加入 1/5 体积的 1.0 mol/L Tris-碱中和。
3 ) 增殖噬菌体以备后用
( 1 ) 将上述洗脱出的噬菌体混合液加入到 10 倍体积的 XL-1 Blue 细胞中（OD550 =0.5~1.0 ) 。
( 2 ) 37℃ 下 200 r/min 摇动孵育 20 min，取出 10 μl 留备测量滴度，参考 12.3.2.3 节中步骤（4 ) 。
( 3 ) 加入 M13KO7 helper 噬菌体，在 200 r/min 摇床 37°C 孵育 45 min。
( 4 ) 转移培养液于 100 ml 的 2YT/carb/kan 培养基中，在 200 r/min，37°C 下摇动过夜。
( 5 ) 利用 PEG/NaCl 沉淀法分离噬菌体，参照 12.3.2.3 节，步骤（8 ) ~（10)。
( 6 ) 重复上述筛选过程 5 次，每轮只用一半的洗脱噬菌体。
3.3.2 噬菌体酶联免疫法测定 hGH 展示水平
在 hGH 展示选择后（见 12.3.3.1)，通过酶联免疫法 [ 2，11 ] 可以测定单个克隆的 hGH 相对于 P8 的展示水平。顺次稀释的 hGH- P8 噬菌体溶液在含固定化 hGHbp 诱饵的板上孵育。洗去未结合的噬菌体，结合的噬菌体经过辣根过氧化物酶偶联的 M13 抗体反应后可以通过光谱学进行检测。从噬菌体浓度对 450 nm 吸收值曲线上，通过比较噬菌体浓度和特定吸收值关系，可以估计出 P8 变异体较野生型 P8 对 hGH 展示水平提高的程度 [11] 。hGH 展示水平高的克隆被送去测定其 DNA 序列，进而推断出融合有 hGH 的 P8 变异体的序列。
( 1 ) 从新鲜的 LB/tet 板上挑出一个含有特定噬菌粒的 E.coli XL-1 Blue 菌株的单克隆，放入 1 ml 加有 M13KO7 helper 噬菌体（1010 pfu/ml ) 和 50 μg/ml 羧苄青霉素（以保持噬菌体）及 5 μg/ml 四环素（以保持 F' 附加体）的 2YT 培养基中。在 200 r/min，37°C 下摇动 2 h，再加入 25 μg/ml 的卡那霉素来选择共转染了 M13KO7 的克隆。再在 200 r/min，37°C 下摇动 6 h，转移培养液于 30 ml 2YT/carb/kan 培养基中。在 200 r/min，37°C 下摇动过夜。
( 2 ) 在 4°C 及 27000 g 下（Sorvall SS-34 转子中，15000 r/min) 离心 10 min。转移上清液于一个含有 1/5 体 积 PEG/NaCl 的干净试管中，室温孵育 5 min。在 4°C 及 12000 g 下（10000 r/min，Sorvall SS-34 转子中）离心 10 min。去除上清液。在 2000 g ( 4000 r/min) 简短离心一下，再用移液管吸走上清液残余。
( 3 ) 重悬噬菌体沉淀小团于 0.5 ml 的 PBS-T-BSA 缓冲液中，将其转移到一个 1.5 ml 的 EP 离心管中。在桌式离心机中用 14000 g 离心 5 min，再转移上清液到一个新的 1.5 ml EP 离心管中。
( 4 ) 利用分光光度计法估计噬菌体浓度。
( 5 ) 用 PBS-T-BSA 缓冲液准备 5 倍系列稀释的噬菌体储液。
( 6 ) 转移 100 μl 的噬菌体溶液到有 hGHbp 包被且 BSA 封闭的 96 孔 Maxisorp 免疫板（见 12.3.3.1 中 1))。温和摇动孵育 1 h。
( 7 ) 去除噬菌体溶液，用 PBS-T 缓冲液洗板 8 次。
( 8 ) 加入 100 μl 的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase) / 抗M13 抗体络合物 ( 用 PBS-T- BSA 缓冲液稀释3000 倍，见 12.2.2.2)。温和摇动孵育 30 min。
( 9 ) 用 PBS-T 缓冲液洗 8 次，再用 PBS 洗 2 次。
( 10 ) 用 100 μl 的 TMB 底物溶液显影 96 孔免疫板。用 100 μl 的 1.0 mol/L H3PO4 溶液终止反应，然后在 96 孔板读板仪中读出 450 nm 的光吸收值。
来源：丁香实验
