以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库模拟抗原的筛选
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以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库模拟抗原的筛选
(1)将单克隆抗体 用包被液CBS稀释，加入酶标板，一般抗体包被浓度为10ug/孔，包被体积为100ul/孔，稍加晃动使孔表面变湿，置于4℃下包被过夜(或37℃慢摇孵育2h)。第二天倾去板中包被液，每孔加入200ul/孔洗板液(PBST05)，静置5rain，甩去洗板液，于无菌干净的滤纸上拍打，以尽量除去剩余的液体，重复洗5次，以下的洗板操作都与此相同。加入封阻液(PBSTOS-1％BSA)200ul，于37℃慢摇孵育1 h。倾去封阻液，尽量出去剩余液体，加入洗板液(PBST05)，洗板5次。
(2)用封阻液(PBST05-1％BSA)稀释噬菌体肽库至1010 TU/ml(～2X1011 病毒颗粒/mi)，同时加入无关鼠单克隆抗体(稀释效价为1：100)，混合后加入抗体孔中100ul/ml，37℃慢摇孵育1h；加入洗板液(PBST05)，洗板5次；再加入洗板液(PBST5)，洗板5次；把板倒扣在吸水纸上拍几下，使孔中没有液体；加入100ul/孔洗脱液，室温慢摇孵育洗脱不超过10min(这步可采用竞争洗脱法，即加入一定浓度的天然抗原，37℃,隆摇孵育60min进行竞争洗脱，将特异性结合在抗上的噬菌体肽竞争下来)。取一条新的酶标板，预先加入
15ul、孔中和液，将洗脱液100//l加入到此酶标板中，使其pH值变为中性(洗脱液颜色由淡黄色转为玫瑰红色)。
(3)将115ul的噬菌体溶液转入事先已放人大肠杆菌K91Kan感受态细胞的15ml试管中，室温慢摇感染10-30min；将上述感染细胞转入2ml含LB-0．2Tet试管中，37℃慢速震荡(～100r/min)培养30-60min。取6/1l上述培养液作噬菌体效价的测定，并在其余的感染细胞培养液中加Tet母液至20ug/ml，37℃震荡(～230r/min)培养过夜(这步也可以用固相扩增的方法，即将感染的细胞培养液涂在3个大的LB-Tet40-Kanl00平板上，于37℃培养过夜)。取6ul上述培养液作10X倍比稀释后，分别以100ul/块平板涂在LB-Tet40-Kanl00平板上，每个稀释度要有重复的平板，倒置平板于37℃培养过夜，计数噬菌体菌落数，计算回收噬菌体的效价和噬菌体的获得率。测定并纪录每次筛选噬菌体的输入量和输出量，通过计算每一轮的噬菌体获得率来检验噬菌体的富集情况。次日按噬菌体扩增和纯化的方法回收和纯化筛选得到的噬菌体，并测定纯化噬菌体的效价，作为下一轮筛选的噬菌体溶液【用固相扩增的方法，则将培养皿上的菌落用LB液体培养基冲洗下来转入离心管中，37℃震荡(270r/min)培养1h后，回收并纯化释放至液体中的噬菌体，其他步骤同上】。一般对同一靶分子筛选3-4次，在第二次筛选时可适当降低包被抗体的浓度，增加筛选压力。
(4)将最后一次筛选洗脱下来的噬菌体中和后，取一部分噬菌体感染大肠杆菌细胞，用固相扩增的方法，即将感染的细胞培养液涂在多个大的LB-Tet40-Kanl00平板上，于37℃培养过夜。这样可得到噬菌体的单克隆化，便于进一步鉴定，同时也可测定噬菌体效价。其他噬菌体不扩增于一30℃保存备用。
