以细胞为靶目标的噬菌体肽筛选结果鉴定
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以细胞为靶目标的噬菌体肽筛选结果鉴定
(1)用细胞 ELISA鉴定方法：分别将体外培养的肿瘤细胞和正常细胞进行消化、记数后制成相同浓度的细胞悬液。96孔细胞培养板中每孔加100弘1细胞悬浊液，使培养板上、下两个孔分别对应相同浓度的肿瘤细胞和正常肝细胞。37℃细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁。每孔加入100ul 3％多聚甲醛固定，1h后用PBST―05、PBST―5分别洗板3次。每孔加封阻液(PBST05―3％BSA)100/Jl，37℃封阻1h。洗板后每孔加噬菌体单克隆100ul，并留一孔不加噬菌体作空白对照。在37℃温育1h，洗板。每孔加噬菌体M13抗血清100ul，37℃温育2h，洗板。每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgGl00ul，37℃温育1h，洗板。每孔OPD底物显色液，振荡显色每孔酶终止液(2mol/LH：S04)，终止显色。细胞板离心，将每孔中的上清显色液以在细胞板上同样位置转移到酶标板中，酶标仪490nm波长读数。按下列公式计算每个克隆的特异结合系数：
每个A值读数均为某噬菌体单克隆在与肿瘤细胞或正常细胞孵育后读数的均值。
(2)荧光显微镜鉴定法：体外培养的肿瘤细胞和正常细胞分别用胰酶消化后，将两种细胞制成相同浓度的悬液，分装于小离心管，每管加l m1 3％多聚甲醛固定30 min。加入PBST05洗3次，每管加1m1PBST05―3％BSA，37℃封阻1h。加入PBST洗3次，加入噬菌体，37℃温育lh。加入PBST洗3次，噬菌体M13抗血清37℃温育2h。加入PBST洗3次，每孔加FITC标记的羊抗兔IgG和PI，振荡、冰育15rain。取一滴溶液滴片，荧光显微镜镜检及拍照。
(3)流式细胞术检测法：取在培养瓶中聚合度达到80％以上的细胞，胰酶消化后，加入适量新鲜的培养基，2 500r/min离心10rain，弃去上清液，加入PBS洗3遍，细胞计数，调节细胞浓度为5X10‘/ml。取1m1充分洗涤后的细胞悬液，2 500r/min离心10min，弃去上清液，加入1m1PBST―1％BSA，37℃封阻1h，PBS洗3遍。加入1m1PBST―1％BSA，再加入各个阳性噬菌体克隆10ul(101‘pfu/m1)，37℃孵育1 h，2 500r/min离心10min，弃去上清液，PBS3遍。加入1m1兔抗噬菌体M13抗体(1：500，用PBST―1％BSA稀释)，37℃孵育1h，2 500r/rain离心10rain，弃去上清液，PBS洗3遍。加入FITC―羊抗兔二抗(1：100，用PBST05―1％BSA稀释)，避光4℃孵育1h，PBS洗3遍，500目尼龙网过滤，流式细胞仪检测。
(4)用蛋白质印迹法来验证目标噬菌体与肿瘤细胞膜蛋白的结合：提取肿瘤细胞和对照正常细胞膜蛋白后采用常规的蛋白质印迹法检测。
