抗体的鉴定

抗体的鉴定

抗体可通过各种各样的物理化学方法及功能分析等进行鉴定，所使用的方法都是最标准的，并会提供抗体的独特性、完整性、纯度及功能等信息。这些方法包括: 醋酸纤维膜上的区带电泳、A28。浓度测定、SDS-PAGE、免疫印迹、等电聚焦及酶联免疫分析（酶免疫分析）。

一、区 带（醋 酸 纤 维）电泳

区带电泳是依据蛋白质的电荷特性将蛋白质彼此分开。我 们 用 Helena Laboratory公司（Beaumont， TX) 的市售商品全套装置，其中含膜条、醋酸纤维素凝胶、转膜器、模板、混合缓冲液。从该公司还可购买电泳槽、电源、固定剂及考马斯亮蓝染色剂，这些不是每套装置都含的部分，必须单独购买。 Helena 的产品中对操作步骤有详细的介绍。

二、操作步骤

(1) 向电泳室中的两个中槽加入水并将电泳槽放入冰箱。

(2) 按照制造商的说明书准备缓冲液，固定剂，及脱色液。

(3) 从保护包装里取出胶, 用滤纸从其一端吸去水分。

(4) 取 2〜5/xl的样品加人模板孔中。每块 胶 最 多 可 加 7 个样本。应该留一个孔作为标准或对照，比如正常血清。让胶吸收样本 5 min。再次吸干胶并取下模板。

(5) 从冰箱中取出电泳槽，向外槽中加入缓冲液。把胶放在电泳槽的中部，使加样端靠近阴极。将膜条放在胶的两端并将其浸泡人缓冲液槽中。它们应迅速变湿。

(6) 将电泳槽盖上槽盖并用导线接通电源。

(7) 打开电源开关并调至 250V 。电泳不要超过 20 min，关闭电源开关并拔掉导线。

(8) 从电泳槽中取出胶。用水冲洗电泳室并将中槽再注人水。将电泳室放回冰箱以备以后使用。

(9) 用考马斯亮蓝（1 0 % 冰醋酸/ 4 0 % 甲醇溶液中含 0. 1 % 考马斯亮蓝）染 胶 15 min。用乙酸/ 甲醇（1 0 % / 4 0 % ，体积比）溶液脱色。

(10) 可以用吹风机或者真空干胶仪进行干燥以作为永久记录。区带电泳所显示蛋白质条带有许多用途。血清中不同的蛋白质依据其种类不同会移动到特定的位置。血 清 中 的 白 蛋 白 浓 度 最 高 ，因而染色最深，并因其带有最大量的负 电 荷 ，电泳时跑得最远。多克隆抗血清中的抗体（PAb) 接近出发点并呈一条弥散的带 。单克隆抗体将会是接近原点清晰独立的条带，不同单克隆抗体将迁移到不同的位置（图 7. 7)，这点可用于区分不同的单克隆抗体或检查同一抗体不同批次间是否一致。
如 图 7. 7 所 示 ，胶上有来自腹水的三种不同的单克隆抗体样本。前三条泳道的单克隆抗体是不同的；每条泳道最上面的条带是单克隆抗体，因各自所带的电荷不同而致它们电泳迁移率也有差别。最 后 两 条 泳 道 条 带 相 似 ，这 些 是 相 同 的 抗 体 ，但来自不同批次的腹水

也可以对胶进行扫描以确定每条带的相对蛋白质含量。用多种分析软件程序都可确定每条条带在总蛋白质中所占的百分比。例如，如果用修正的 Lo w r y 分析来测定腹水中蛋白质的浓度 [8]，单克隆抗体的浓度可用这个公式进行计算：密度扫描所得抗体占总蛋白质的百分比 X 总 mg/m l 蛋白质= mg/m l 单克隆抗体。