流式细胞仪技术

测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光,经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，以调出显示和进行分析。

一、样品的制备

细胞必须做成单个细胞悬浮状态，细胞浓度要保证在1～2×10⁶/ml。

二、悬浮细胞的固定

细胞悬液中加入等量的8%甲醛（用Hank‘S液配）4℃下固定12～18小时或细胞悬于PBS中，缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇，使终浓度为70%，冰浴30分钟或于细胞悬液中，缓慢加入冷丙酮，使终浓度为85% 。

三、流式细胞仪检测方法

1、细胞的碘化丙锭（PI）染色法：PI嵌入DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍，可用于测定DNA的含量，细胞周期，细胞凋亡Ap峰。

2、吖啶橙染色法（变色法）：吖啶橙染料可使细胞DNA和RNA着色，激发不同的荧光，激发的波长为488nm，红色荧光为DNA，绿色荧光为RNA或单链DNA（根据变色→细胞死活，分裂/静止）。

3、PI标记抗体检测：可用于检测癌基因异常表达的蛋白，如：N-ras，Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白。

4、以溴化脱氧尿嘧啶（BrdU）和Hoechst33258染色法：BrdU可在细胞合成DNA时代替胸腺嘧啶，染料Hoechst33258荧光值在410～580nm之间，可以检测细胞增殖周期。

5、异硫氰酸荧光素（FIFC）染色法：着色细胞在488nm下DNA呈红色荧光，蛋白质呈绿色荧光。

6、荧光素标记抗体的应用

用荧光素标记一抗/或二抗测定膜表面蛋白或用穿孔素进行膜穿孔后先加入一抗结合后漂洗，再加入荧光素标记二抗，结合后在激发波作用下发出荧光，测标记百分率或荧光强度，进行统计分析。