流式细胞仪技术概述

流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。

它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器（光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下：

1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。

2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。

3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。

一、样品的制备

流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号，因此，细胞必须做成单个细胞悬浮状态，不能聚集，也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异（如特异单抗），而且不允许渗透至载液中。

标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系，要经Ficoll分离，作单细胞分离处理，但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞，需采用酶消化法（胰蛋白酶、胶原酶等），化学法（EDTA、EGTA和柠檬酸盐）消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS，柠檬酸盐的浓度为40μmol/L.

并同时采用机械分散法，将经消化处理的膨松组织，用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重悬，最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。细胞浓度要保证在1～2×106/ml。

若标本用于测定单个细胞，需加入1～5mg/L的DNAase，将有助于阻止破碎细胞释放的DNA造成细胞再聚集，但是若分离的细胞要作DNA含量测定之用时，则切勿加DNAase。

二、悬浮细胞的固定

上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析，如果染色和流式分析要拖后进行，或为了提高染色效果，则要将细胞预固定。乙醇固定是常用的方法。

1、固定方法：

　　(1)甲醛法：在细胞悬液中加入等量的8%甲醛（用Hank’S液配）4℃下固定12～18小时。

　　(2)乙醇法：细胞悬于PBS中，缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇，使终浓度为70%，冰浴30分钟。

　　(3)丙酮法：于细胞悬液中，缓慢加入冷丙酮，使终浓度为85%。

2、实例：

　　(1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液，将细胞制成1×106细胞的悬液。

　　(2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95%乙醇，连续搅拌使乙醇终浓度达70%。

　　(3)该细胞可在4℃下保存数日。

　　(4)分析前先用1000r/min离心10分钟，弃去乙醇，再将细胞悬于PBS中或要求的试剂中。

三、流式细胞仪分析的应用

(一)非染色细胞的光散射

一个粒子（如细胞）出现在一束光线中，立即会干扰该光束，造成该光束入射光的重分布，该细胞所获能量则以衍散、折射、反射等复杂的参数形式重新发射出来，这些参数与细胞体积、表面构象、内部结构形成函数关系，可测低角前面约10°的光散射及90°的光散射。

一般认为，90°位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响，而低角前面10°位置的光散射则主要代表细胞大小。光散射测量方法如下：

(1)将细胞悬浮于HBSS中，浓度介于1×106～2×106/ml浓度之间。

(2)以悬浮细胞平衡盐溶液（HBSS）充满含鞘液的细胞贮藏池。

(3)设定细胞流量为500个/S（秒），以获得最佳测定结果。

(二)染色法

1、细胞的碘化丙锭（propiolium iodide，PI）染色

　　PI和EB（溴化乙锭）为同类物质，与EB一样，PI嵌入DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍，PI的荧光强度约为EB染色的1.8倍，以488nm波长激发，DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。

　　1.1 小鼠Lewis肺癌细胞（3LL）DNA含量测定方法

　　(1)从C57BL/6小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗；

　　(2)去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块；

　　(3)小碎片移入1.20×38mm注射针，加压使其通过，于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。

　　(4)将200～300μL细胞悬液（5×105细胞/ml）中加入3ml PI（50μg/ml），染色3LL细胞，于4℃存放20～30分钟。

　　(5)测定580～750nm之间的发射荧光，以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。

　　注：PI染色液：0.1%柠檬酸钠1000ml+PI5mg+1%Nonide P40水。

　　1.2 培养细胞DNA的流式细胞仪分析

　　(1)从培养皿中吸去培养基，以HBSS冲洗二次；

　　(2)加入PI5ml于培养皿中，在4℃放10分钟；

　　(3)用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。

　　1.3 完整细胞DNA的PI染色

　　(1)70%乙醇固定的细胞悬液，离心，去固定液；

　　(2)室温条件下加入PI染色一批细胞（105～106细胞/ml），时间为30分钟，然后行流式细胞仪分析。