流式细胞仪

流式细胞仪操作注意点:

1. 因实验需保证待检测样品细胞为单细胞悬液，因此在细胞培养、制备阶段，贴壁细胞需用先用胰酶消化成单个细胞，而后再后收集待测样品细胞；胸腺、脾脏和淋巴结等外周免疫器官，主要由免疫细胞组成，只需直接将脏器经钢网研磨即可制成单细胞悬液；实体脏器肺脏、肝脏和肿瘤组织内含有较多的结缔组织，而实体脏器细胞之间一般结合紧密，所以直接简单的将脏器进行研磨是无法得到理想的单细胞悬液的，因此，研磨前需将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶消化，而后再将消化后的组织用研磨棒直接研磨，从而得到理想的单细胞悬液（实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，如果研究目标不是实体细胞，而是脏器内浸润的免疫细胞，可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞）。而后对收集到的理想的单细胞悬液进行离心、洗涤、封闭、标记荧光素偶联抗体后，即可进行流式分析。2. 调节电压时，如果检测的目标细胞体积较小，可以适当提高电压值，使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离；如果检测的目标细胞体积较大，可以适当降低电压值，使所有的目标细胞群完整显示于流式图中，防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外。

3. 关于样本的封闭，并不是标记荧光素偶联抗体之前必须封闭样品，一般样品细胞与流式抗体的种属来源是不同的，如标记人的细胞的荧光素偶联抗体一般来源于小鼠，人细胞的FcR也不一定能够与小鼠来源的荧光素偶联抗体的Fc段结合，但是，也有可能因为种属关系较近，或者在一定环境条件下这种不同种属间的Fc段和FcR也能结合，实验者很难判断实验过程中这种结合是否会发生，但是在标记荧光素偶联抗体前封闭样品却可以保证这种非特异性结合一定不会发生。所以，当条件允许时，实验者最好选择对实验样品进行封闭处理。

第一次做流式细胞术可能会有一些挑战和需要注意的地方。以下是一些建议：

样本准备：样本的准备非常重要，因为它直接影响到最终的流式细胞结果。确保样本是单细胞悬浮液，没有凝固或胶状物质。如果样本含有红细胞，需要进行去红细胞裂解处理。在样本处理过程中要小心，避免细胞丢失或损伤。

抗体选择：根据需要选择正确的抗体，对于初次操作者，建议先选择针对细胞表面分子的抗体，如CD3、CD4等。在选择抗体时，要考虑到抗体的特异性和亚型，确保能够正确地区分不同的细胞亚群。

操作条件：在操作流式细胞仪时，要保持清洁和严谨的操作，避免细胞污染和误差。尽量避免抗体接触到外部环境或阳光，以免影响其稳定性和特异性。在操作过程中，注意各步骤的温度和时间，确保反应条件符合要求。

数据分析：流式细胞仪所得到的数据比较多，需要进行数据分析和处理。初次操作者建议先学习基本的数据分析方法，如细胞计数和亚群分析，逐渐掌握高级数据分析方法。

安全注意事项：操作流式细胞仪时需要注意安全问题，如佩戴手套和口罩、避免抗体接触眼睛等。

总之，流式细胞仪是一项非常有用的实验技术，需要注意的细节很多，初次操作者需要耐心学习和不断实践，掌握技巧和经验。

注意参数的设置，然后后续可以再做做荧光

1. 减少非特异荧光染色

（1）细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。

（2）封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。

2. 单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。

3. 如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。

4.其他

流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪，是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。