原理
制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用本法）
1. 用 10％ FCS-RPMl 1640 调整细胞浓度为 5×106-1×107／ml；
2. 取 40 μl 细胞悬液加入预先有特异 McAb（5-50 μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加 50 μl 1:20（用 DPBS 稀释）灭活正常兔血清；
3. 4℃ 静置 30 min；
4. 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2 ml，离心 1000 r/min，5 min；
5. 弃上清，加入 50 μl 工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇；
6. 4℃ 静置 30 min；
7. 用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2 ml，离心 1000 r/min，5 min；
8. 加适量固定液（如为 FCM 制备标本，一般加入 1 ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100-500 μl 固定液）；
9. FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察，（标本在试管中可保存5-7天）
材料与仪器
细胞样品、兔血清、第二抗体、单克隆抗体、FCS-RPMI 1640、DPBS、玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜；
步骤
制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用本法）
1. 用 10％ FCS-RPMl 1640 调整细胞浓度为 5×106-1×107／ml；
2. 取 40 μl 细胞悬液加入预先有特异 McAb（5-50 μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加 50 μl 1:20（用 DPBS 稀释）灭活正常兔血清；
3. 4℃ 静置 30 min；
4. 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2 ml，离心 1000 r/min，5 min；
5. 弃上清，加入 50 μl 工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇；
6. 4℃ 静置 30 min；
7. 用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2 ml，离心 1000 r/min，5 min；
8. 加适量固定液（如为 FCM 制备标本，一般加入 1 ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100-500 μl 固定液）；
9. FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察，（标本在试管中可保存5-7天）
注意事项
1. 整个操作在 4℃ 下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高 10 倍的 NaN3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白 Fc 受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
来源：丁香实验
