免疫荧光染色实验中染料的选择。

CF 647、Alexa Fluor 647, ATTO 647N, DyLight649等远红外荧光染料；

以花青素为基础的远红外荧光染料CF 647 比Cy 5、Alexa Fluor 647 明亮。

CF 660、Alexa Fluor® 660, Allophycocyanin (APC)等介于远红外近红外之间的荧光染料；

目前，市场上抗体及蛋白标记的荧光染料主要有CFTM系列(BIOTIUM, USA); Alexa Fluor®系列(Life technology, USA); DyLight系列; Cy系列; IR Dye系列等等。使用最多的为Alexa Fluor®系列和CFTM系列。

选择方案：

1、蓝色（350-450nm处激发）

CF 350、Alexa Fluor 350、AMCA等----亮蓝和紫外光激发。

2、绿色（488nm处激发）

CF 488A、Alexa Fluor 488、FITC、FAM、DyLight 488、Cy2等----针对488nm 氩离子激光器的流式。

3、橙红色（543-555nm处激发）

CF 543、Alexa Fluor 546、ATTO550, Cy 3, DyLight 549, Rhodamine (TRITC) 匹配543nm的橙色荧光染料；

4、红色（568-594nm处激发）

CF 568、Alexa Fluor® 568, ATTO 565, Rhodamine Red等568nm处红色荧光染料。

5、远红外（620-660nm处激发）

CF 620R、LightCycler Red 640等620nm处。

TRITC,RRX,TR：TRITC经常和FITC一起用于双标记实验中，也可以使用RRX或TR，但TR会产生较高的背景。在使用装有氪氢灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，且和这两者的重叠很少。

PE：常和FITC一起用于流式细胞术双标记实验。

FITC：FITC是广泛使用的荧光基团，但其最大的缺点是淬灭快，使用抗淬灭剂可以减轻。

花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更稳定，且在表面荧光显微镜下，Cy2的荧光FITC更强。Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更弱。二者常在共聚焦显微实验中作多标记。但Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察，因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。

尽量选择光谱重叠比较少的荧光基团进行组合，进行两个不同蛋白的共染色。标记好荧光的细胞片应今早观察，或者用封片剂封片后在4℃或者-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱，还可以利用免疫荧光专用细胞处理试剂进行预处理减少自发荧光或荧光信号的淬灭。