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TSA多重免疫荧光染色的实验步骤

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实验流程:
多靶点免疫荧光染色的实验操作与普通单标记免疫组化流程相似。试剂盒中的荧光染料可以在HRP酶的作用下将信号共价结合到抗原上,随后即可衔接下一轮单标染色,直至全部标记完成,即可复染DAPI后封片观察。

1.脱蜡水合:
1)新鲜二甲苯浸片10min,重复3次。
2)梯度乙醇浸片,100% 5min;95% 5min;70% 2min。
3)灭菌水洗片1min,重复3次。
4)10%中性福尔马林浸片10min,灭菌水洗片1min,重复3次。
2.微波修复:
1)将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中,用抗原修复液1×工作液浸没。
2)将修复杯置于微波炉内高火煮沸。
3)低火维持15min。
4)取出室温自然冷却至室温。
3.封闭:
1)去除玻片上残存洗液。
2)用组画笔圈出玻片上的样本区域,滴加封闭剂,覆盖样本区域。
3)室温保湿震荡10min。
4.一抗孵育:
1)去除玻片上的封闭剂。
2)用移液器滴加稀释的一抗溶液,浸没样本区域。
3) 37℃恒温保湿震荡孵育1hr。
4)用1×TBST buffer浸洗玻片3min,重复1次。
5.二抗孵育:
1)去除玻片上残存的洗液。
2)直接滴加二抗溶液,浸没样本区域。
3)室温保湿震荡孵育10min。
4)用1×TBST buffer 浸洗玻片3min,重复1次。
6.荧光染色放大信号:
1)去除玻片上残存洗液。
2)用移液器在玻片上滴加1X染料工作液100ul(使用信号放大液按1:100稀 释),浸没样本区域。
3)室温 保湿震荡孵育10 min。
4) 1X TBST buffer浸洗玻片,室温浸片3 min,重复3次
5) 微波修复,室温自然冷却至室温。
6)灭菌水洗片1次,1X TBST buffer浸片2min。
7)单染结束,封片观察或追加后续染色。
7.封片:
1)去除玻片上残存洗液,滴加DAPI工作液,室温保湿孵育5min。
2)1×TBST buffer浸洗玻片,室温浸片3min。
3)用灭菌水洗片2min。
4)待玻片微干,用移液器在玻片上滴加超强抗淬灭封片剂,浸没样本区域。
5)加盖玻片,指甲油封片。
6)阅片。
本试剂盒仅供科研使用。


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