材料与仪器
抗体，血清；
RPMI 1640，DPBS，洗涤液，固定液；
玻璃管，塑料管，离心机，显微镜；
步骤
1. 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）；
2. 用 10 ％ FCS RPMI 1640 调整细胞浓度为 5×106～1×107 /ml；
3. 取 40 μl 细胞悬液加入预先有特异性 McAb（5～50 μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加 50 μl 1:20（用 DPBS 稀释）灭活正常兔血清，4 ℃ 30 min；
4. 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2 ml 左右，1000 rpm × 5 min；
5. 弃上清，加入 50 μl 工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇，4 ℃ 30 min；
6. 用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2 ml 左右，1000 rpm × 5 min；
7. 加适量固定液（如为 FCM 制备标本，一般加入 1 ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入 100～500 μl 固定液）；
8. FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存 5～7 天）；
注意事项
1. 整个操作在 4 ℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高 10 倍的 NaN3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白 Fc 受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
常见问题
1. DPBS （×10， 贮存液）
NaCl 80 g，KCl 2 g，蒸馏水加至 1000 ml，Na2HPO4 11.5 g，临用时用蒸馏水 1:10 稀释，KH2PO4 2 g
2. 洗涤液
DPBS 900 ml，FCS 50 ml（终浓度 5％），4％ NaN3 50 ml（终浓度 0.2％）
3. 固定液
DPBS 1000 ml，葡萄糖 20 g（终浓度 2％），甲醛 10 ml，NaN3 0.2 g （终浓度 0.02％）
来源：丁香实验
