原理
活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
材料与仪器
抗体 血清
RPMI1640 DPBS 洗涤液 固定液
玻璃管 塑料管 离心机 显微镜
RPMI1640 DPBS 洗涤液 固定液
玻璃管 塑料管 离心机 显微镜
步骤
1. 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）
3. 取40 μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50 μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清，4 ℃ 30 min
4. 用洗涤液洗涤2 次，每次加洗涤液2 ml左右，1000 rpm×5 min
5. 弃上清，加入50 μl工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇，4 ℃ 30 min
6. 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2 ml左右，1000 rpm×5 min
2. 用10 ％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×106～1×107 /ml
3. 取40 μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50 μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清，4 ℃ 30 min
4. 用洗涤液洗涤2 次，每次加洗涤液2 ml左右，1000 rpm×5 min
5. 弃上清，加入50 μl工作浓度的羊抗鼠（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇，4 ℃ 30 min
6. 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2 ml左右，1000 rpm×5 min
7. 加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1 ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500 μl固定液）
8. FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）
注意事项
1. 整个操作在4 ℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
常见问题
一、附录
1. DPBS （×10， 贮存液）
2. 洗涤液
3. 固定液
1. DPBS （×10， 贮存液）
NaCl 80 g，KCl 2 g，蒸馏水加至1000 ml，Na2HPO4 11.5 g，临用时用蒸馏水1∶10稀释，KH2PO4 2 g
2. 洗涤液
DPBS 900 ml，FCS 50 ml（终浓度5 ％），4 ％ NaN3 50 ml（终浓度0.2 ％）
3. 固定液
DPBS 1000 ml，葡萄糖 20 g（终浓度2 ％），甲醛 10 ml，NaN3 0.2 g （终浓度0.02 ％）
来源：丁香实验
