【原创】Western Blot成功要素
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1929
一、Western Blot成功要素
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、Western Blot成功要素
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、Western Blot成功要素
| <center> 实验步骤</center> | <center> 影响Western Blot成功的要素</center> |
| <center> 电泳分离蛋白</center> | <center> 蛋白抽提，蛋白定量，样品制备，电泳</center> |
| <center> 转膜</center> | <center> 膜的选择，膜的确认，特殊处理</center> |
| <center> 封闭</center> | <center> 封闭液的选择，封闭条件优化</center> |
| <center> 漂洗</center> | <center> 漂洗液的配制与选择</center> |
| <center> 抗体孵育</center> | <center> 抗体选择，抗体稀释倍数优化</center> |
| <center> 底物孵育</center> | <center> 恰当的发光或显色底物</center> |
| <center> 曝光</center> | <center> 曝光时间掌控，X-光片，显影定影试剂</center> |
| <center> 后Western Blot选择</center> | <center> 抗体剥离缓冲液（蛋白印迹膜再生液），底片北京去除剂</center> |
