染色体技术（1）
丁香园论坛
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外周血培养基配制
一、配制用水
培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准，水的电阻应为200万欧姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。
二、培养基
培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌，使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理。
三、血清
培养中常使用小牛血清（或胎牛血清）。血清亦不能高压灭菌，无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体，置4℃冰箱存放待用。配制时含量视培养细胞种类、时间而定，一般用10—15%。由于血清成分复杂、条件不易控制，可选用无血清培养基。
四、抗菌素
为防止培养时期细菌的污染，可在培养基中添加适当抗菌素，一般用量与组织细胞培养相同：卡那霉素100单位/毫升，或双抗--青霉素100单位/毫升，链霉素100微克/毫升。
五、植物血凝素（PHA）
非增殖期的细胞不能制备染色体，如人外周血淋巴细胞，但在离体培养过程中，在PHA的作用下，可被刺激转化为淋巴母细胞而进入有丝分裂。经实验测定其分裂高峰分别于培养后44—48小时和68—72小时。
PHA有粘多糖，蛋白质两种重要成分。粘多糖促使有丝分裂，蛋白质起凝集作用。PHA激活的细胞数随其浓度而增加，直至全部免疫活性细胞均被激活为止，但PHA浓度过高会引起凝集，一般采用4%浓度为好。
细胞学技术的一般环节
一、纺锤体阻断剂（Spindle inhibitor）
在有丝分裂过程中，随着纺锤丝的形成，染色体被牵引到一起难以观察其形态。纺锤体的形成在于细胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡，因此，改变细胞质的粘度，即可破坏纺锤体形成，从而使得染色体均匀散开，且染色体缢痕区更为清楚。
在培养中使用的纺锤体阻断剂为秋水仙素，在终止培养前加入适量秋水仙素，使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量分裂相供分析之用。秋水仙素的浓度范围比较宽，一般使用浓度0.05—0.8微克/毫升，在终止培养前处理2—4小时。但在实际工作中需要借助浓度和处理时间来控制染色体的收缩程度。秋水仙素作用时间越长，被阻断的中期分裂相越多，但是染色体也越凝聚和收缩，所以还视各实验室经验而定。
二、低渗液（hypotonic solution）
低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075M KCl为低渗液（具体情况取决于实际操作，鉴于实验的连续性和稳定性，本实验室采用0.35%KCl），其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，15－25分钟，以预实验条件为准。
三、固定液
固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称的卡诺氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
四、滴片
滴片使细胞悬液从一定高处落在载玻片上，淋巴母细胞膜破裂，染色体分散开。载玻片可用冰片和干片，效果均好。滴片后需空气干燥。
五、Giemsa染色
Giemsa染料不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和甲醇的混合物，配制后原液储存。在常规染色中，并不比其他染料优越，但在显带技术中，却是无可比拟的。
Giemsa工作液在使用前临时配制，浓度可在2.5-10%之间（原液2份加pH7.4磷酸缓冲液10－40份）。染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。
人类外周血染色体制备
一、原理
人外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素（PHA），这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。人体的1ml外周血内一般含有约1×106～3×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。
二、用品和试剂
1．5ml注射器（7号针尖），培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20分钟。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。
2．超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。
3．试剂：
（1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以缓冲pH。完全溶解后经0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌。
（2）肝素钠（肝素）：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，15磅20分钟灭菌。
（3）秋水仙碱（秋水仙素〕，生理盐水配制成10μg/ml浓度，15磅20分钟灭菌，分装，置－20℃。
（4）低渗液：0.35％KCl。
（5）固定液（Carnoy固定液） 甲醇∶冰乙酸（3∶l），临时配制。
（6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制。
（7）磷酸缓冲液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等体积混和。
（8）5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。
三、操作步骤
（一）细胞培养
1．培养基的配制：
在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：
RPMI-1640 84ml
小牛血清 15ml
PHA 3支
肝素钠 1ml
卡那霉素 终浓度为100单位/ml
以5% NaHCO3（无菌）或1N HCl调pH至7.2－7.4。
用刻度吸管将培养液分装入培养瓶（10ml/瓶），4℃备用。
2．采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血0.3—0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30—40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。
3．培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。
4．秋水仙素处理：终止培养前2—4小时，在培养液中加入秋水仙碱（用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml）。
以上步骤均需无菌操作
（二）染色体制备
1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8—10分钟，弃上清液。
2．低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗15—25分钟。
3．预固定：低渗后加入0.5ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8—10分钟。
4．一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。
5．二固定、三固定：同一固定。
6．制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
7．滴片：吸取细胞悬液自10—20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干。
8．染色：1:10 Giemsa染色5—10分钟，细水洗去多余染液，气干。
9．镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。
四、注意事项
l．培养温度应严格控制在37±0.5℃，培养液最适合pH为7.2—7.4。
2．秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。
3．低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。
4．离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。
5．固定液应在使用前临时配制。
6．载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。
一、配制用水
培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准，水的电阻应为200万欧姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。
二、培养基
培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌，使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理。
三、血清
培养中常使用小牛血清（或胎牛血清）。血清亦不能高压灭菌，无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体，置4℃冰箱存放待用。配制时含量视培养细胞种类、时间而定，一般用10—15%。由于血清成分复杂、条件不易控制，可选用无血清培养基。
四、抗菌素
为防止培养时期细菌的污染，可在培养基中添加适当抗菌素，一般用量与组织细胞培养相同：卡那霉素100单位/毫升，或双抗--青霉素100单位/毫升，链霉素100微克/毫升。
五、植物血凝素（PHA）
非增殖期的细胞不能制备染色体，如人外周血淋巴细胞，但在离体培养过程中，在PHA的作用下，可被刺激转化为淋巴母细胞而进入有丝分裂。经实验测定其分裂高峰分别于培养后44—48小时和68—72小时。
PHA有粘多糖，蛋白质两种重要成分。粘多糖促使有丝分裂，蛋白质起凝集作用。PHA激活的细胞数随其浓度而增加，直至全部免疫活性细胞均被激活为止，但PHA浓度过高会引起凝集，一般采用4%浓度为好。
细胞学技术的一般环节
一、纺锤体阻断剂（Spindle inhibitor）
在有丝分裂过程中，随着纺锤丝的形成，染色体被牵引到一起难以观察其形态。纺锤体的形成在于细胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡，因此，改变细胞质的粘度，即可破坏纺锤体形成，从而使得染色体均匀散开，且染色体缢痕区更为清楚。
在培养中使用的纺锤体阻断剂为秋水仙素，在终止培养前加入适量秋水仙素，使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量分裂相供分析之用。秋水仙素的浓度范围比较宽，一般使用浓度0.05—0.8微克/毫升，在终止培养前处理2—4小时。但在实际工作中需要借助浓度和处理时间来控制染色体的收缩程度。秋水仙素作用时间越长，被阻断的中期分裂相越多，但是染色体也越凝聚和收缩，所以还视各实验室经验而定。
二、低渗液（hypotonic solution）
低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075M KCl为低渗液（具体情况取决于实际操作，鉴于实验的连续性和稳定性，本实验室采用0.35%KCl），其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，15－25分钟，以预实验条件为准。
三、固定液
固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称的卡诺氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
四、滴片
滴片使细胞悬液从一定高处落在载玻片上，淋巴母细胞膜破裂，染色体分散开。载玻片可用冰片和干片，效果均好。滴片后需空气干燥。
五、Giemsa染色
Giemsa染料不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和甲醇的混合物，配制后原液储存。在常规染色中，并不比其他染料优越，但在显带技术中，却是无可比拟的。
Giemsa工作液在使用前临时配制，浓度可在2.5-10%之间（原液2份加pH7.4磷酸缓冲液10－40份）。染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。
人类外周血染色体制备
一、原理
人外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素（PHA），这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。人体的1ml外周血内一般含有约1×106～3×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。
二、用品和试剂
1．5ml注射器（7号针尖），培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20分钟。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。
2．超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。
3．试剂：
（1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以缓冲pH。完全溶解后经0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌。
（2）肝素钠（肝素）：称取0.2g溶于100ml双蒸水中，浓度为0.2%，15磅20分钟灭菌。
（3）秋水仙碱（秋水仙素〕，生理盐水配制成10μg/ml浓度，15磅20分钟灭菌，分装，置－20℃。
（4）低渗液：0.35％KCl。
（5）固定液（Carnoy固定液） 甲醇∶冰乙酸（3∶l），临时配制。
（6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制。
（7）磷酸缓冲液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等体积混和。
（8）5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。
三、操作步骤
（一）细胞培养
1．培养基的配制：
在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：
RPMI-1640 84ml
小牛血清 15ml
PHA 3支
肝素钠 1ml
卡那霉素 终浓度为100单位/ml
以5% NaHCO3（无菌）或1N HCl调pH至7.2－7.4。
用刻度吸管将培养液分装入培养瓶（10ml/瓶），4℃备用。
2．采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血0.3—0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30—40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。
3．培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。
4．秋水仙素处理：终止培养前2—4小时，在培养液中加入秋水仙碱（用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml）。
以上步骤均需无菌操作
（二）染色体制备
1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8—10分钟，弃上清液。
2．低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗15—25分钟。
3．预固定：低渗后加入0.5ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8—10分钟。
4．一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。
5．二固定、三固定：同一固定。
6．制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
7．滴片：吸取细胞悬液自10—20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干。
8．染色：1:10 Giemsa染色5—10分钟，细水洗去多余染液，气干。
9．镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。
四、注意事项
l．培养温度应严格控制在37±0.5℃，培养液最适合pH为7.2—7.4。
2．秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。
3．低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。
4．离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。
5．固定液应在使用前临时配制。
6．载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。
