器材：

①离心机

②培养箱

③水浴锅

④小漏斗、滤纸

⑤Nucleonond BAC 100 柱

⑥Qiagen 大提质粒试剂盒

⑦分光光度计

⑧脉冲场凝胶电泳（PFGE）系统

⑨薄壁玻璃毛细管

试剂：

①材料：DH10B 大肠埃希菌

②氯霉素

③10％ 甘油

④琼脂糖培养基、TBE

⑤限制性内切酶、RNA 酶

胚胎移植的基本过程可分为如下几步：

一、BAC 克隆的获取

（一）查找所需的 BAC 克隆

1．在 Ensembl Genome 数据库中查找 BAC 克隆

（1）进入 Ensembl Genome Browser 网址 http：／／www．ensemblgenomes．org／。

（2）进入页面后，点击页面右上角的「Vertebrates」，进入搜索页面。

（3）在搜索菜单（Search）里，选择你想要的基因数据库，如「mouse」或「human」等。输入你想要的基因的名称，如「H2-D1」然后按「go」。

（4）在「By Feature type」下选择数据库「GENE」的「mouse」，页面刷新后就可以看到所需的基因信息，点击基因名字进入新页面。

（5）按「Region in detail」连接到所需基因的具体页面，你就可以看到围绕你所需基因的基因群图谱。

（6）在左边的面板上，选择「Configure this page」。在最左边的菜单「Sequence and assembly」下面，选择「Clones」，右边则会出现相关数据，在「Enable／disable all External data」下，选择「BAC map m38」，点击前面的方格，选择」Labels.」，按窗口右上角的「V」图形符号（表示 Save and close），页面刷新后，BACs 会在＂Region in detail．」下面列出。可以发现如下 BAC 载体：「RPCI-23-11503」「RPCI-23-331E12」「RPCI-23-336F22"「RPCI-23-431E4""RPCI-23-446C22""RPCI-24-273L24""RPCI-24-338A13」「RPCI-24-338B13」。

（7）也可选择另一个 BAC 文库，如「CHORI29 clones m38」。点击 CHORI29 clones m38 前面的方格，选择」Labels.」按窗口右上角的「V」图形符号（表示 Save and close），页面刷新后，BACs 会在」Region indetail．」下面列出，可发现「CH29-488C17」「CH29-70J21」。

（8）通常选择 2～3 个 BAC 克隆用于转基因研究。理论上，所得的 BAC 中应尽可能多地包含所需目的基因的 5＇和 3＇端序列。这可以增加基因的内源性表达。

2．在 NCBI 网站查找 BAC 克隆（同样以 H2-D1 为例示）

（1）NCBI BAC 数据库网址：http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／clone／

（2）在输入框中输入所需 BAC 基因名称，如「H2-D1」，按旁边的「search」键，则可以看到搜索结果，如果想缩小范围，也可以同时输入「library name」「organism」等信息。

（3）选定所需基因后，点击基因名字，页面刷新后就能见到基因的简单信息，如「clone DBname」「Allele Name」等。点击「Entrez Gene」后的基因名称，进入基因具体信息页面。

（4）下拉页面，在「NCBI Reference Sequences（RefSeq）」下的「RefSeqs of Annotated Genomes：XXXXX」 目录下可以找到所需基因序列的链接。

（5）目录下有多个基因，可以通过对比「Range」确定基因位置和大小，再在「GenBank」「FASTA」和「Sequence Viewer（Graphics）」3 个连接中选择一个找到所需序列。

（二）输出和保存 BAC 克隆的 DNA 序列

1．记录所需基因的 BAC 编号。点击所需 BAC 会显示 BAC 克隆名称、BAC 插入序列在染色体上的起始定位（如 RPCI-23-331E12，start 35252064-end 35417643）。

2．在」Region in Detail」下的「Location」中输入目标基因序列段（17：35252064-35417643），然后点击「GO」。页面上会显示出 BAC 中的 DNA 序列。

3．选择屏幕左边的「export data」。

4．最上面的窗口处确定输出的格式。如 FASTA File、GenBank、EMBL 的 Flat File。如使用 SeqBuilder 时也可选择 EMBL：在菜单中选用「EMBL」格式，然后点击「NEXT」。下一个窗口会让你选择超链接、文档、或者是文档的压缩包。选择「TEXT」。

5．所需的 TEXT 格式文档会在新窗口中打开。全选文档，把需要的信息复制并保存备用。

6．用 DNAStar 或 Vector NT 等 DNA 软件处理 BAC 插入序列，制备 DNA 限制性内切图谱，以供鉴定 BAC 使用。

（三）订购 BAC 克隆

1．访问 http：／／bacpac．chori．org／order clones．php．

2．在搜索框中输入 BAC 名字，符合条件的 BAC 就会被列出。指定一个 LB Stab 或 FISH 验证的克隆。点击「Clone（s）Verify」按钮。

3．如果 BAC 克隆已被确定，「Clone Ordering Page」将会打开。按照指示付款，就能得到所需的 BAC 克隆。

4．BAC 克隆存在于 DH10B 大肠埃希菌中，穿刺在琼脂糖培养基中寄过来。4℃ 可储存 1 周。

5．得到菌株后，应把其重新涂平板，挑出克隆摇菌过夜后，放入 10％ 甘油中-80℃ 保存。

（四）BAC 克隆的鉴定

二、BAC DNA 纯化

（一）培养细菌

1．用含（15pg／mL）氯霉素的 LB 培养基（2 mL）。

2．取 1 mL 细菌培养液，4 ℃，5000 r／min 离心后重悬于 10％ 甘油，-80 ℃ 储存。

3．用含（15 pg／mL）的氯霉素 LB 培养基（250 mL），摇晃培养过夜（37 ℃，250 r／min）。

4．冷却培养基至 4 ℃。

（二）准备试剂

1．在细胞悬浮缓冲液中加入 RNA 酶。

2．在小漏斗中加入滤纸，然后把小漏斗插入 Nucleonond BAC 100 柱中。用 10 mL 平衡缓冲液平衡滤纸和柱子，等其自然流干。滤纸可以防止细菌裂解物堵塞柱子。

（三）细菌裂解

1．细菌培养液，5000 r／min、4 ℃ 离心 10 分钟，弃上清。

2．用细胞悬浮缓冲液重悬细胞（每 250 mL 菌液使用 30 mL 缓冲液悬浮）。如加入细菌太多，可以适当增加缓冲液的量。Macherey-Nagel.Marligen，QiNucleobond 公司的缓冲液都可以通用。如有必要，Qiagen 大提质粒试剂盒的缓冲液可以替代Macherey-Nagel 缓冲液使用。

3．加入等量的细胞裂解液，轻柔混合，不要使用 vortex 混匀。室温下放置 5 分钟。

4．加入等量的中和溶液。轻柔的上下翻转，动作不要太剧烈，不要使用 vortex 混匀。可见产生黏性的白色沉淀物。离心沉淀物 10 分钟，15000 r／min。

（四）提取 BAC DNA

1．把中和的细胞溶解产物倒入漏斗中，利用重力作用自然过滤。弃去滤液和漏斗。

2．在柱子中加入 30 mL 洗涤缓冲液，利用重力作用自然流干。

3．在柱子中加入 15 mL 洗脱液，让洗脱液利用重力作用自然流入收集管。

4．在洗出液中加入 11 mL 异丙醇，4 ℃、10000 r／min 离心 40 分钟（注意不能超过 10000 r／min，否则 50 mL 离心管易破裂）。

5．离心后会产生白色易碎的 DNA 沉淀物。有时候他们很小，甚至难以见到。由于 BAC DNA 沉淀很容易粘到离心管壁上，处理时一定要小心。如果能见到很大的白色沉淀物，那么纯化阶段可能出了问题（如忘了加 RNA 酶或是缓冲液已经过期）。

6．用 3 mL 70％ 无水乙醇重悬沉淀物，然后把他们平分到 2 个微量离心管中。4 ℃ 高速离心 10 分钟。

7．弃去上清后把产物干燥 3 分钟。不要让他们完全干燥，不然 DNA 容易断裂。

8．再使用 0.2 μ mol／L 注射过滤器过滤 1 mLPA 缓冲液。不要用这种过滤器过滤 BAC DNA 溶液，否则 BAC DNA 会粘在滤膜上而丢失。

9．用 300 μl 滤过的 PA 缓冲液重悬 BAC DNA。DNA 在 PA 缓冲液中会很容易溶解。如果有些沉淀没有溶解，那可能是一些在纯化过程中不规则操作产生的杂质。

（五）BAC DNA 定量

1．打开分光光度计，选择应用程序。

2．抬起活动臂并用移液管加 1 μl 水到基座上；作为对话框中的应答，然后点「OK」键，开始校准。

3．将加样座的上、下面用擦镜纸擦干净。

4．用移液管加 1 μl 的缓冲液 PA 到基座中再点击「Blank」校零。

5．清洁基座，加入 1 μl 的 BAC DNA 溶液，点击「measure」。

6．在测定样品后要使用擦镜纸擦干净，同时用移液管加 1 μl 水作为最后的样品。

7．将数据保存在计算机，清洁基座，退出软件程序。

三、BAC 克隆完整性鉴定-制作 BAC DNA 限制性内切图谱

1．用限制性内切酶消化 BAC DNA（250～550 ng）。

2．在冷却室里组装脉冲场凝胶电泳（PFGE）系统或者将一个循环冷却仪与 PFGE 系统相连。

3．制备 0.8％ 的琼脂糖凝胶（注：确定胶中无气泡，如果凝胶不符要求则弃之不用；每一个气泡都会影响 BAC DNA 的迁移。）

4．分别在凝胶中加入溴化乙啶、在凝胶电泳槽中加入 2000 mL 0.5 倍 TBE。

5．用剃须刀片从 Midrange RFG Marker II 琼脂糖块上切下薄片，然后将其放入凝胶样品槽里。（注：不需要制备 BAC 样品 DNA 琼脂块，可将 BAC 样品 DNA 直接加入 6 倍的 DNA 样品缓冲液；就如普通的琼脂糖凝胶水平电泳那样上样）。

6．每个凝胶加样槽加入 250～500 ng 的限制性内切酶消化过的 BAC DNA，并在其中一个槽中加入没有消化的 BAC DNA 作为对照。

7．开始脉冲凝胶电泳。脉冲场凝胶电泳设置为：初始转换（switch）时间：1 秒，最终转换（switch）时间：25 秒，电泳时间：17 小时，6V，角度：120°（注：跑胶需要一整夜；如果电流高了，需要核对一下 TBE 缓冲液的浓度，因为电流太高结果条带会变型）。

8．跑完胶后将凝胶泡在溴化乙啶溶液中 30 分钟，然后在紫外线下显像 DNA 条带（注：溴化乙啶是一种致突变物质，务必遵守安全手册，并无害化处理废弃的溴化乙啶）。

9．电泳结果分析

（1）DNA 标记物可以产生分散条带用于测定 DNA 分子量。在标记物槽中加入过多的 DNA 标记物会使 DNA 条带模糊。

（2）加入不同数量的 BAC DNA 以保证条带的清晰。例如，RNA 污染的样品，分光光度计就会得出 DNA 样品浓度较高。在这种情况下不是所有的样品都包含了足够的 BAC DNA 而且 DNA 条带会较暗。被污染的杂质 RNA 也会在凝胶中迁移，不会对 BACDNA 片段的显像有干扰。

（3）将实际的限制性内切酶图谱与用计算机软件分析的结果相比较。如果不吻合，可以从 C．H．O．R．I．再一次免费得到同样的 BAC。

（4）将鉴定结果准确的 BACDNA 可以在 4 ℃ 的 PA 缓冲液中保存两年，期间不会降解。

四、BAC 基因的重组与修饰

利用重组（recombineering）技术可以方便地修饰 BAC 基因。重组技术能够很方便地克隆出大片段 DNA，也可以在基因中的任意位点造成特异突变。其步骤见本篇第二章第二节。

五、BAC DNA 转基因

1．用 0.2 μm 滤过的 PA 缓冲液并且稀释到 10 倍或是 100 倍（最佳精度）。滤过的 PA 缓冲液用于稀释 BACDNA 至 0.5 ng／μl。DNA 储藏在 4 ℃ 中，并且不要冷冻。

2．将 DNA 整分成 4～6 份，每份 50 μl，并装入无菌微管中。

3．使用移液管（WPI cal．No．TW100-4）将微注射的针头从薄壁玻璃毛细管中拉出。

4．将拉针的后面放置于重悬浮的 BACDNA 中，并且等待 1～2 分钟后，让液体经过毛细管到达针尖。

5．在透镜能看到针尖之后，把针安装在显微注射器上，并且将其放置于装满受精卵的显微注射室内。

6．完成原核的显微注射。显微注射前适当地准备一下 BAC DNA，实验过程会比较顺畅，也会如同质粒转基因 DNA 溶液一样容易完成。

7．没有必要为了 BAC DNA 显微注射而改变显微注射针的几何特性。

8．受精卵的生存率在 BAC DNA 显微注射后会相对于质粒 DNA 转基因显微注射要小。