染色体技术（2)
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骨髓细胞染色体标本的制备
一、原理
骨髓染色体标本制备通常用于白血病患者，特别是慢性或急性粒细胞性白血病，因为骨髓反映粒系统细胞增生情况，这些病人不宜用外周血。即使是淋巴细胞性白血病，也不主张用外周血，因为加PHA刺激外周血培养，只能获得正常淋巴细胞分裂相，并不能反映那些病理淋巴细胞的染色体改变。
骨髓细胞属不断增殖的细胞，培养可分短期培养和直接制片法，无论哪种其培养液中均不需加PHA。
二、用品和试剂
同外周血染色体制备。
三、操作步骤
（一）短期培养法
1．取材、培养：从髂骨取骨髓液0.2—0.5ml，无菌注入装有5ml培养液的培养瓶中，37℃培养23—25小时后，加入秋水仙碱（终浓度为0.07μg/ml），继续培养3—4小时，收获。
2．染色体制片：低渗、固定、制片及染色同实验一。
（二）直接制备法
1．从髂骨抽取0.3—0.5ml，立即注入浓度为0.07μg/ml的秋水仙碱的生理盐水5ml中，以吸管轻轻吸动，将骨髓中脂肪颗粒充分吸掉，1000rpm离心8分钟，弃上清。
2．加入同样浓度的秋水仙碱生理盐水2—3ml，室温放置2—3小时，离心弃上清。
3．染色体制片：低渗、固定、制片及染色同外周血染色体制备。
羊水细胞染色体标本的制备
一、原理
人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可区分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。AF细胞在再培养中一开始就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。F细胞在再培养中潜在的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。通常在培养后3—4天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合再培养作染色体分析。大约在第7天出现的AF细胞可被用于染色体制备。如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第二次羊膜穿刺。
二、用品和试剂
灭菌刻度离心管，0.25%胰蛋白酶，生长培养基（成分：RPMI-1640 80%，灭活小牛血清20%），其余同外周血染色体制备。
三、操作步骤
1．10—20ml无菌羊水，1000—1500rpm离心10分钟，吸去上清，保留1ml羊水和沉降的细胞。
2．用吸管使之悬浮，并吸至25ml细胞培养瓶中，每瓶含约0.3—0.5ml细胞悬液，再向其加入3ml生长培养基。
3．摇匀后37℃静止培养5—7天（不要挪动，以免影响细胞贴壁）。
4．倒置显微镜观察，可见部分细胞贴壁生长并形成细胞小岛，此时可以换液。
5．常规细胞培养至第9—11天即可收获细胞。
6．终止培养前4小时加秋水仙碱，使终浓度为0.1微克/毫升。
7．培养结束用1ml胰蛋白酶液消化5分钟，终止消化，并转移至10ml离心管中，1000rpm离心10分钟，收集细胞。
8．常规制备染色体，步骤同外周血染色体制备。
胸腹水染色体标本制备
一、原理
某些肿瘤细胞可脱落入胸腹水中，并继续生长、增值。因此，由胸腹水细胞可制备较好的染色体标本。胸腹水细胞染色体分析对恶性肿瘤具有辅助诊断的价值。如分裂相多，异倍性，有结构畸变，常支持阳性诊断。
二、用品和试剂
同外周血染色体制备。
三、操作步骤
l．新鲜胸腹水20—40毫升，以1000rpm离心10分钟。弃去上清液。
2．加入37℃预温的营养液RPMI-1640 10ml。将细胞打匀。
3．向细胞悬液加入秋水仙碱。使其终浓度为0.2—0.5μg/ml。置37℃温育60—90分钟。
4．1000rpm离心10分钟，弃上清液。
5．低渗：加入37℃的低渗液8ml处理5—10分钟。
6．固定、制片、染色同实验一外周血染色体制备。
染色体GTG标本制备
一、原理
非显带染色体除可根据形态分辨部分染色体，其他多数染色体难以确认，而显带技术则可使染色体纵向长度上出现不同带纹，以辨认全部染色体。GTG即G带，Trypsin（胰酶），Giemsa的简写。Giemsa染料是噻嗪--曙红染料，染色体的着色有赖于在原位形成噻嗪--曙红（2∶1）的沉淀物。着色首先取决于二个噻嗪分子同DNA结合，在此基础上再结合一个曙红分子，其次取决于一个疏水环境，以利于染料沉淀而着色。通过胰酶的显带预处理可除去阴性G带区的疏水蛋白，或使它们的结构变成更疏水状态。由此可知，在G显带中抽取的蛋白往往是疏水的，且主要来自阴性G带区。
二、用品和试剂
0.25%胰酶（0.85％NaCl配制，pH为7.2—7.4），余同实验一。
三、操作步骤
1．标本老化：
按常规制备人外周血淋巴细胞染色体标本（未染色）气干后，经78℃烘箱2—3小时。 取出置37℃恒温箱3天后预处理。
2．胰酶预处理：
将染色体标本浸入胰酶溶液（已置4℃冰箱稳1小时以上）中40—50秒，取出立即水洗去多余胰酶。
3．Giemsa染色：
1∶10 Giemsa染色液染色5—10分钟，洗去多余染料，气干。
4．镜检：油镜下可见分散良好的染色体纵轴上呈现深浅不同带纹，即为可读标本。
四、注意事项
1．常规制备的染色体标本，要有较多分裂相，分散良好，染色体长度适中。
2．GTG带的关键在于胰酶处理的时间。若染色体仍着色较深，带纹不明，则预处理时间不足，应延长预处理时间；若染色体变粗并显出毛糙边缘，甚至呈糊状，则为预处理过度，应适当缩短处理时间。
3．Giemsa染色时间要适中，时间短，着色不够，深浅带反差小；时间过长，着色深，亦影响带纹反差，不易识别。
染色体CBG标本制备
一、原理
异染色质在整个分裂间期及分裂期都是浓缩的，因而其大小较为恒定。它们通常位于着丝粒附近，或在染色体臂上呈现“团块”，这些染色质主要由C显带技术呈现，故称为C带。CBG即C带、Ba(OH)2、Giemsa的简写。C带的根本特征是选择性地从染色体臂抽取DNA，但在C带区有很强抗性，仍保留大部分DNA，Giemsa染色后可见效果良好的C带。抽取DNA的过程由三个连续操作形成。首先，酸处理可使DNA脱嘌呤，但未使DNA骨架断裂；其次热碱处理可使DNA变性，促进继发的DNA溶解；最后，热盐溶液使DNA骨架断开并使碎片溶解进入溶液中。因此，最终以Giemsa染料显示出DNA的不同分布。在优良的C带标本中，常染色质只呈现中期染色体的一般外貌，结构异染色质区着色很深。
C带在检查1、9、16特别是Y染色体的异质区时尤为重要。
二、用品和试剂
0.2N HCl，5% Ba(OH)2，2×SSC，Giemsa染色液。恒温水浴箱，染色缸。其余同外周血染色体制备。
三、操作步骤
（一）方法一
l．酸处理：常规制作的染色体标本（未染色）置0.2N HCl（室温）处理15—30分钟。水洗。
2．碱处理：浸入已预温至56℃的5% Ba(OH)2水溶液10分钟。水洗。
3．热盐处理：置2×SSC溶液（67℃）处理60—90分钟。水洗。
4．染色：l∶10 Giemsa染色液染色10—5分钟。水洗。气干。
5．镜检。
（二）方法二
l．酸处理：常规制作的染色体标本（未染色）置0.2N HCl（室温）处理60分钟。水洗。
2．碱处理：浸入1% Ba(OH)2水溶液（50℃）中15—20秒。水洗。
3．热盐处理：置2×SSC溶液（60℃）90分钟。水洗三次。
4．染色：l∶10 Giemsa染色液染色10分钟。水洗。气干。
5．镜检。
一、原理
骨髓染色体标本制备通常用于白血病患者，特别是慢性或急性粒细胞性白血病，因为骨髓反映粒系统细胞增生情况，这些病人不宜用外周血。即使是淋巴细胞性白血病，也不主张用外周血，因为加PHA刺激外周血培养，只能获得正常淋巴细胞分裂相，并不能反映那些病理淋巴细胞的染色体改变。
骨髓细胞属不断增殖的细胞，培养可分短期培养和直接制片法，无论哪种其培养液中均不需加PHA。
二、用品和试剂
同外周血染色体制备。
三、操作步骤
（一）短期培养法
1．取材、培养：从髂骨取骨髓液0.2—0.5ml，无菌注入装有5ml培养液的培养瓶中，37℃培养23—25小时后，加入秋水仙碱（终浓度为0.07μg/ml），继续培养3—4小时，收获。
2．染色体制片：低渗、固定、制片及染色同实验一。
（二）直接制备法
1．从髂骨抽取0.3—0.5ml，立即注入浓度为0.07μg/ml的秋水仙碱的生理盐水5ml中，以吸管轻轻吸动，将骨髓中脂肪颗粒充分吸掉，1000rpm离心8分钟，弃上清。
2．加入同样浓度的秋水仙碱生理盐水2—3ml，室温放置2—3小时，离心弃上清。
3．染色体制片：低渗、固定、制片及染色同外周血染色体制备。
羊水细胞染色体标本的制备
一、原理
人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可区分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。AF细胞在再培养中一开始就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。F细胞在再培养中潜在的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。通常在培养后3—4天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合再培养作染色体分析。大约在第7天出现的AF细胞可被用于染色体制备。如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第二次羊膜穿刺。
二、用品和试剂
灭菌刻度离心管，0.25%胰蛋白酶，生长培养基（成分：RPMI-1640 80%，灭活小牛血清20%），其余同外周血染色体制备。
三、操作步骤
1．10—20ml无菌羊水，1000—1500rpm离心10分钟，吸去上清，保留1ml羊水和沉降的细胞。
2．用吸管使之悬浮，并吸至25ml细胞培养瓶中，每瓶含约0.3—0.5ml细胞悬液，再向其加入3ml生长培养基。
3．摇匀后37℃静止培养5—7天（不要挪动，以免影响细胞贴壁）。
4．倒置显微镜观察，可见部分细胞贴壁生长并形成细胞小岛，此时可以换液。
5．常规细胞培养至第9—11天即可收获细胞。
6．终止培养前4小时加秋水仙碱，使终浓度为0.1微克/毫升。
7．培养结束用1ml胰蛋白酶液消化5分钟，终止消化，并转移至10ml离心管中，1000rpm离心10分钟，收集细胞。
8．常规制备染色体，步骤同外周血染色体制备。
胸腹水染色体标本制备
一、原理
某些肿瘤细胞可脱落入胸腹水中，并继续生长、增值。因此，由胸腹水细胞可制备较好的染色体标本。胸腹水细胞染色体分析对恶性肿瘤具有辅助诊断的价值。如分裂相多，异倍性，有结构畸变，常支持阳性诊断。
二、用品和试剂
同外周血染色体制备。
三、操作步骤
l．新鲜胸腹水20—40毫升，以1000rpm离心10分钟。弃去上清液。
2．加入37℃预温的营养液RPMI-1640 10ml。将细胞打匀。
3．向细胞悬液加入秋水仙碱。使其终浓度为0.2—0.5μg/ml。置37℃温育60—90分钟。
4．1000rpm离心10分钟，弃上清液。
5．低渗：加入37℃的低渗液8ml处理5—10分钟。
6．固定、制片、染色同实验一外周血染色体制备。
染色体GTG标本制备
一、原理
非显带染色体除可根据形态分辨部分染色体，其他多数染色体难以确认，而显带技术则可使染色体纵向长度上出现不同带纹，以辨认全部染色体。GTG即G带，Trypsin（胰酶），Giemsa的简写。Giemsa染料是噻嗪--曙红染料，染色体的着色有赖于在原位形成噻嗪--曙红（2∶1）的沉淀物。着色首先取决于二个噻嗪分子同DNA结合，在此基础上再结合一个曙红分子，其次取决于一个疏水环境，以利于染料沉淀而着色。通过胰酶的显带预处理可除去阴性G带区的疏水蛋白，或使它们的结构变成更疏水状态。由此可知，在G显带中抽取的蛋白往往是疏水的，且主要来自阴性G带区。
二、用品和试剂
0.25%胰酶（0.85％NaCl配制，pH为7.2—7.4），余同实验一。
三、操作步骤
1．标本老化：
按常规制备人外周血淋巴细胞染色体标本（未染色）气干后，经78℃烘箱2—3小时。 取出置37℃恒温箱3天后预处理。
2．胰酶预处理：
将染色体标本浸入胰酶溶液（已置4℃冰箱稳1小时以上）中40—50秒，取出立即水洗去多余胰酶。
3．Giemsa染色：
1∶10 Giemsa染色液染色5—10分钟，洗去多余染料，气干。
4．镜检：油镜下可见分散良好的染色体纵轴上呈现深浅不同带纹，即为可读标本。
四、注意事项
1．常规制备的染色体标本，要有较多分裂相，分散良好，染色体长度适中。
2．GTG带的关键在于胰酶处理的时间。若染色体仍着色较深，带纹不明，则预处理时间不足，应延长预处理时间；若染色体变粗并显出毛糙边缘，甚至呈糊状，则为预处理过度，应适当缩短处理时间。
3．Giemsa染色时间要适中，时间短，着色不够，深浅带反差小；时间过长，着色深，亦影响带纹反差，不易识别。
染色体CBG标本制备
一、原理
异染色质在整个分裂间期及分裂期都是浓缩的，因而其大小较为恒定。它们通常位于着丝粒附近，或在染色体臂上呈现“团块”，这些染色质主要由C显带技术呈现，故称为C带。CBG即C带、Ba(OH)2、Giemsa的简写。C带的根本特征是选择性地从染色体臂抽取DNA，但在C带区有很强抗性，仍保留大部分DNA，Giemsa染色后可见效果良好的C带。抽取DNA的过程由三个连续操作形成。首先，酸处理可使DNA脱嘌呤，但未使DNA骨架断裂；其次热碱处理可使DNA变性，促进继发的DNA溶解；最后，热盐溶液使DNA骨架断开并使碎片溶解进入溶液中。因此，最终以Giemsa染料显示出DNA的不同分布。在优良的C带标本中，常染色质只呈现中期染色体的一般外貌，结构异染色质区着色很深。
C带在检查1、9、16特别是Y染色体的异质区时尤为重要。
二、用品和试剂
0.2N HCl，5% Ba(OH)2，2×SSC，Giemsa染色液。恒温水浴箱，染色缸。其余同外周血染色体制备。
三、操作步骤
（一）方法一
l．酸处理：常规制作的染色体标本（未染色）置0.2N HCl（室温）处理15—30分钟。水洗。
2．碱处理：浸入已预温至56℃的5% Ba(OH)2水溶液10分钟。水洗。
3．热盐处理：置2×SSC溶液（67℃）处理60—90分钟。水洗。
4．染色：l∶10 Giemsa染色液染色10—5分钟。水洗。气干。
5．镜检。
（二）方法二
l．酸处理：常规制作的染色体标本（未染色）置0.2N HCl（室温）处理60分钟。水洗。
2．碱处理：浸入1% Ba(OH)2水溶液（50℃）中15—20秒。水洗。
3．热盐处理：置2×SSC溶液（60℃）90分钟。水洗三次。
4．染色：l∶10 Giemsa染色液染色10分钟。水洗。气干。
5．镜检。
