染色体技术（3）
丁香园
2726
人类染色体姊妹染色单体差别染色
姊妹染色单体区分染色法(Sister chromatid differentiation，SCD）是70年代中期发展起来的染色体处理技术。Latt（1973）在培养的细胞中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），当用Hoechst33258 荧光染料染色时，发现了姊妹染色单体的色差反映和它们之间互换的现象。1974年KO Renberg和Froeed-Lender改进了这一技术，建立了较简易的BrdU-Giemsa技术。这种技术用于研究细胞周期、染色体半保留复制、染色体的分子结构和畸变，以及DNA的复制、损伤与修复等一系列重要理论问题，还可以用于分析姊妹染色单体互换（Sister chromatid exchange, SCE）频率。由于SCE能灵敏地检测染色体的变化，表现出剂量-效应关系。因此，目前已把SCE列为检测致突变物、致癌物地常规指标之一。
一、原理
5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxy-urdine, BrdU）在DNA的复制过程中，掺入新合成的链并占有胸腺嘧啶（thymidine, T）的位置。根据DNA的半保留复制规律，哺乳动物或人的细胞在BrdU的培养液中经历了两个周期后，它的两条姊妹染色单体的DNA双链在化学组成上有了差别。当染色体的DNA链的两条多核苷酸链都被BrdU所替换，Giemsa染色显示浅色，如果染色体的DNA链中仅有一条多核苷酸链被BrdU所替换，Giemsa染色显示深色。应用姊妹染色单体区分染色法（SCD）研究来自一个染色体的两条单体之间在同一个位点发生同源片段的交换，称为姊妹染色单体互换。
二、用品和试剂
45℃水浴，紫外线灯（20W）。余同外周血染色体制备。
试剂： BrdU溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下称取BrdU 2mg，然后在无菌室内加入无菌生理盐水4ml，用黑纸避光，4℃冰箱保存，新鲜配置。1×SSC溶液：0.15mol/L NaCl，0.015mol/L 柠檬酸钠。
三、操作步骤
l．细胞培养：常规培养人外周血淋巴细胞，24h后，加入BrdU使其终浓度为20μg/ml。
2．继续避光培养48小时，终止培养前2—3小时加秋水仙碱。
3．培养结束收获细胞，常规制备染色体，操作同实验一。
4．染色体制片在37℃恒温箱内老化24小时或室温放置1—2天。
5．将染色体制片的玻片正面向上平铺在恒温（45℃）水浴锅上，在玻片上滴加已预热至45℃的1×SSC溶液。
6．将紫外灯放在恒温水浴上，灯与标本垂直，其外加盖报纸数张以阻挡紫外线。照射距离为6cm，时间15min。
7．照射完毕后以蒸馏水洗去1×SSC。
8．1∶10 Giemsa染色5分钟。
9．自来水细流冲洗去多余染料，干燥，镜检。
10．计数SCE。选择染色体分散较好，数目为46的中期分裂相20个进行观察计数，凡在染色单体端部出现的互换计为一次SCE，在染色单体中间出现的互换计为两次SCE。凡在着丝粒部位发生一次互换，判断不是两条染色单体在着丝粒部发生的扭转，计为一次SCE，但另列入“着丝粒区互换（CME）”一项。
核仁组织者区的AgNO3染色
一、原理
1976年Goodpasture等应用银染色技术，使9种哺乳动物的核仁组织者区（NORs）特异性的染为黑色，该技术被称为Ag-As的银染技术，银染色阳性的NORs被称为Ag-NORs，与Hsu等人用原位分子杂交得到的结果比较，表明Ag-NORs就是18S+28S核糖体基因（rDNA）的分布区，后证实染色的不是rDNA基因本身，而是与rDNA转录有关的一种酸性蛋白。因此，银染色的是有转录活性的NORs。
二、用品和试剂
染色体制片，水浴锅。
试剂：50%硝酸银溶液：5g硝酸银（AR）溶解在10ml蒸馏水中，保存在铝箔包裹的玻璃容器内，可稳定保存1年。明胶显影液∶2g 明胶粉末溶解在99ml蒸馏水中，加1ml甲酸。
三、操作步骤
l．在一培养皿底部放一张蒸馏水润湿的滤纸，上放两根竹签，置水浴内保温60℃。
2．将玻片标本正面向上平放其上，将50%硝酸银溶液和明胶显影液以2∶1体积混匀，立即加至玻片上，覆以盖片，至玻片标本呈现褐色为止，一般3—4min。
3．自来水流洗去盖片和染料，空气中晾干。
4．镜检。
四、注意事项
如银染的染色体形态过浅，可用2% Giemsa复染1—3min.
人体间期细胞X—小体的制备
一、原理
1949年Barr等发现，在雌性体细胞中的两条X染色体有一条（或这条的大部分）处于凝集不活动状态，从而形成X-小体（或称X-染色质、性染色质、Barr小体）。进而发现，所有哺乳类雌体细胞中都有一条这种表现的X染色体，当在个用雌或雄体中，有多于2条X染色体时，在间期细胞内除一条外，其余均形成X-小体。
人类正常的男女体细胞中，22对常染色体并无区别，但其性染色体分别为XY和XX。女性的两条X染色体中，有一条在间期呈现浓缩状态，可由适当的染料显示。正常女性间期细胞中X小体阳性率约为30—50%。
二、仪器、用品及试剂
光学显微镜，恒温水浴箱；
牙签、载玻片、染色缸；
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶l）70%乙醇，硫堇染液；
5N HCl，0.2%甲苯胺兰染液。
三、操作步骤
（一）方法一
l．取材、涂片：取女性口腔上皮细胞均匀涂布在洁净载玻片上。
2．固定：涂片后立即95％乙醇中固定30分钟（不可干燥）。气干。
3．染色：玻片在蒸馏水中冲洗几次后5N HCl（22℃）水解10分钟，蒸馏水洗去多余HCl，硫堇染色30分钟。水洗。
4．镜检、气干后即可镜检。若背景颜色过深可在75%乙醇、95%乙醇中分色后再镜检。
（二）方法二
l．取女性口腔上皮细胞涂片。待干燥。
2．Carnoy固定液中固定15分钟。干燥。
3．5N HCl中10分钟。水洗。干燥。
4．0.2%甲苯胺兰染色2—5分钟。水洗。气干。
5．镜检。
四、注意事项
l．涂片时应均匀涂成单层，取材细胞要多些。取材前应漱口。
2．镜检应选择完整、核质中颗粒均匀的细胞观察，X-小体大小约为1μm，多位于细胞核边缘。
3．统计X-小体阳性率，计数应选300—500个细胞。
五、试剂
1．硫堇染液配方：
①4%硫堇原液：4g硫堇粉末置研钵中以50%乙醇100ml研磨溶解。过滤。
②Michaelies缓冲液：醋酸钠9.714g，巴比妥钠14.714g加双蒸水至500ml。
③硫堇工作液（PH5.7）：0.1N HCl 32ml
Michaelies缓冲液28 ml
4%硫堇原液400ml
2．甲苯胺兰染液配方：
0.2g甲苯胺兰粉末溶于100ml双蒸水中即可。
姊妹染色单体区分染色法(Sister chromatid differentiation，SCD）是70年代中期发展起来的染色体处理技术。Latt（1973）在培养的细胞中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），当用Hoechst33258 荧光染料染色时，发现了姊妹染色单体的色差反映和它们之间互换的现象。1974年KO Renberg和Froeed-Lender改进了这一技术，建立了较简易的BrdU-Giemsa技术。这种技术用于研究细胞周期、染色体半保留复制、染色体的分子结构和畸变，以及DNA的复制、损伤与修复等一系列重要理论问题，还可以用于分析姊妹染色单体互换（Sister chromatid exchange, SCE）频率。由于SCE能灵敏地检测染色体的变化，表现出剂量-效应关系。因此，目前已把SCE列为检测致突变物、致癌物地常规指标之一。
一、原理
5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxy-urdine, BrdU）在DNA的复制过程中，掺入新合成的链并占有胸腺嘧啶（thymidine, T）的位置。根据DNA的半保留复制规律，哺乳动物或人的细胞在BrdU的培养液中经历了两个周期后，它的两条姊妹染色单体的DNA双链在化学组成上有了差别。当染色体的DNA链的两条多核苷酸链都被BrdU所替换，Giemsa染色显示浅色，如果染色体的DNA链中仅有一条多核苷酸链被BrdU所替换，Giemsa染色显示深色。应用姊妹染色单体区分染色法（SCD）研究来自一个染色体的两条单体之间在同一个位点发生同源片段的交换，称为姊妹染色单体互换。
二、用品和试剂
45℃水浴，紫外线灯（20W）。余同外周血染色体制备。
试剂： BrdU溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下称取BrdU 2mg，然后在无菌室内加入无菌生理盐水4ml，用黑纸避光，4℃冰箱保存，新鲜配置。1×SSC溶液：0.15mol/L NaCl，0.015mol/L 柠檬酸钠。
三、操作步骤
l．细胞培养：常规培养人外周血淋巴细胞，24h后，加入BrdU使其终浓度为20μg/ml。
2．继续避光培养48小时，终止培养前2—3小时加秋水仙碱。
3．培养结束收获细胞，常规制备染色体，操作同实验一。
4．染色体制片在37℃恒温箱内老化24小时或室温放置1—2天。
5．将染色体制片的玻片正面向上平铺在恒温（45℃）水浴锅上，在玻片上滴加已预热至45℃的1×SSC溶液。
6．将紫外灯放在恒温水浴上，灯与标本垂直，其外加盖报纸数张以阻挡紫外线。照射距离为6cm，时间15min。
7．照射完毕后以蒸馏水洗去1×SSC。
8．1∶10 Giemsa染色5分钟。
9．自来水细流冲洗去多余染料，干燥，镜检。
10．计数SCE。选择染色体分散较好，数目为46的中期分裂相20个进行观察计数，凡在染色单体端部出现的互换计为一次SCE，在染色单体中间出现的互换计为两次SCE。凡在着丝粒部位发生一次互换，判断不是两条染色单体在着丝粒部发生的扭转，计为一次SCE，但另列入“着丝粒区互换（CME）”一项。
核仁组织者区的AgNO3染色
一、原理
1976年Goodpasture等应用银染色技术，使9种哺乳动物的核仁组织者区（NORs）特异性的染为黑色，该技术被称为Ag-As的银染技术，银染色阳性的NORs被称为Ag-NORs，与Hsu等人用原位分子杂交得到的结果比较，表明Ag-NORs就是18S+28S核糖体基因（rDNA）的分布区，后证实染色的不是rDNA基因本身，而是与rDNA转录有关的一种酸性蛋白。因此，银染色的是有转录活性的NORs。
二、用品和试剂
染色体制片，水浴锅。
试剂：50%硝酸银溶液：5g硝酸银（AR）溶解在10ml蒸馏水中，保存在铝箔包裹的玻璃容器内，可稳定保存1年。明胶显影液∶2g 明胶粉末溶解在99ml蒸馏水中，加1ml甲酸。
三、操作步骤
l．在一培养皿底部放一张蒸馏水润湿的滤纸，上放两根竹签，置水浴内保温60℃。
2．将玻片标本正面向上平放其上，将50%硝酸银溶液和明胶显影液以2∶1体积混匀，立即加至玻片上，覆以盖片，至玻片标本呈现褐色为止，一般3—4min。
3．自来水流洗去盖片和染料，空气中晾干。
4．镜检。
四、注意事项
如银染的染色体形态过浅，可用2% Giemsa复染1—3min.
人体间期细胞X—小体的制备
一、原理
1949年Barr等发现，在雌性体细胞中的两条X染色体有一条（或这条的大部分）处于凝集不活动状态，从而形成X-小体（或称X-染色质、性染色质、Barr小体）。进而发现，所有哺乳类雌体细胞中都有一条这种表现的X染色体，当在个用雌或雄体中，有多于2条X染色体时，在间期细胞内除一条外，其余均形成X-小体。
人类正常的男女体细胞中，22对常染色体并无区别，但其性染色体分别为XY和XX。女性的两条X染色体中，有一条在间期呈现浓缩状态，可由适当的染料显示。正常女性间期细胞中X小体阳性率约为30—50%。
二、仪器、用品及试剂
光学显微镜，恒温水浴箱；
牙签、载玻片、染色缸；
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶l）70%乙醇，硫堇染液；
5N HCl，0.2%甲苯胺兰染液。
三、操作步骤
（一）方法一
l．取材、涂片：取女性口腔上皮细胞均匀涂布在洁净载玻片上。
2．固定：涂片后立即95％乙醇中固定30分钟（不可干燥）。气干。
3．染色：玻片在蒸馏水中冲洗几次后5N HCl（22℃）水解10分钟，蒸馏水洗去多余HCl，硫堇染色30分钟。水洗。
4．镜检、气干后即可镜检。若背景颜色过深可在75%乙醇、95%乙醇中分色后再镜检。
（二）方法二
l．取女性口腔上皮细胞涂片。待干燥。
2．Carnoy固定液中固定15分钟。干燥。
3．5N HCl中10分钟。水洗。干燥。
4．0.2%甲苯胺兰染色2—5分钟。水洗。气干。
5．镜检。
四、注意事项
l．涂片时应均匀涂成单层，取材细胞要多些。取材前应漱口。
2．镜检应选择完整、核质中颗粒均匀的细胞观察，X-小体大小约为1μm，多位于细胞核边缘。
3．统计X-小体阳性率，计数应选300—500个细胞。
五、试剂
1．硫堇染液配方：
①4%硫堇原液：4g硫堇粉末置研钵中以50%乙醇100ml研磨溶解。过滤。
②Michaelies缓冲液：醋酸钠9.714g，巴比妥钠14.714g加双蒸水至500ml。
③硫堇工作液（PH5.7）：0.1N HCl 32ml
Michaelies缓冲液28 ml
4%硫堇原液400ml
2．甲苯胺兰染液配方：
0.2g甲苯胺兰粉末溶于100ml双蒸水中即可。
