【原创】Cas9基因敲除技术详述
丁香园
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<font>【</font><strong>CRISPR/Cas9系统的发现历史和应用-@华夏凯奇</strong><font>】</font></center>
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<strong>-兼谈八卦。水平有限，不准确和班门弄斧之处，还望大家斧正。</strong></center>
一、CRISPR系统的发现-从细菌的获得性免疫说起
CRISPR系统实际是细菌的一种获得性免疫系统。细菌被phage侵染之后，可以获得phage的DNA片段整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，从对phage形成免疫。
1） 早在1987年，日本人在大肠杆菌中发现有串联间隔重复序列。但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。2002年才正式命名为CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).
2） 随着测序技术和生物信息学的发展，2005年，三个研究组同时发现间隔序列（图中红色箭头所示）和侵染细菌的病毒或phage高度同源。从而推测，这一系统可能是类似于siRNA一样，是细菌抵抗Phage的一种机理。
（这些和植物的siRNA, 高等动物的获得性免疫一样，都是获取入侵病毒的一个片段形成记忆，从而再次遭到入侵时可以对抗入侵的一种方式）
这中间还有很多故事（<font>mark先，待补充，还有adaptation的过程的发现</font>），比如，
1） Phage上和CRISPR重复序列同源的序列突变后，Phage又可以重新可以侵染细菌。这显示在这一系统的工作过程中存在着一个序列配对机制。
2） 有些Cas蛋白突变后，细菌还可以获得入侵的DNA片段整合进基因组，但不能降解外源的DNA片段。这证明Cas系统中有的蛋白负责获取并整合外源DNA片段，而另一些酶负责在再次入侵时降解外源DNA。
3） 在Cas9功能不清楚时，其实就发现这个基因上的某些点突变可以导致整个系统不work。等Cas9的核酸酶的身份揭晓时，再回去看以前的数据，一切都豁然开朗了。这些突变恰恰就是Cas9核酸酶的活性位点。
二：谜团逐渐解开-从嗜热链球菌说起
2007年Science上又发表了一篇文章，作者是DANISCO公司的科学家，讲的是关于Streptococcus Thermophilus（嗜热链球菌），这个菌大家可能不熟悉，但他们的产品大家可能天天吃。这是工业上生产酸奶的菌种。工业生产中常遇到的问题就是这些乳酸菌会被Phage侵染，因此这些食品生产企业需要开发各种抗Phage的策略和分离抗phage的菌株，研究也发现抗Phage的菌株和敏感的菌株在CRIPSR的这些位点有差别，前面也讲到其他研究组发现CRISPR中间的重复序列和Phage的序列高度同源。于是，他们就想看一看通过增加和敲除CRISPR位点中间的重复序列是不是可以调节乳酸菌对Phage的敏感性。果然，实验结果正如他们所料。
随着研究的进一步深入，大家逐渐地意识到，细菌抵抗外界入侵的流程大致如上图所示，Cas位点编码多个核酸酶和解旋酶，他们把入侵的DNA切割，整合到CRISPR的重复序列中，形成记忆。当再次遭到入侵时，转录出RNA，Cas蛋白复合物利用这些和入侵的DNA同源的RNA去切割摧毁外源的DNA。
三：Type I and Type III CRISPR系统
随后对不同的菌的基因组测序及其他研究工作的积累，也使得CRIPSR的机理逐渐清晰。越来越多的不同菌中的CRISPR系统被发现，随后研究者们根据他们降解外源的遗传物质的方法，将他们分为了三类。如图中的Type I and Type III. 这两套系统由于参与的蛋白众多，需要几个复合物共同作用才能发挥作用，使得它不宜操作和改造。但其他几个系统的发现的过程也是非常值得一讲的，都是非常漂亮的工作。（<font>mark先，</font><font>待补充</font>）
四：窗户纸就快捅破了-Cas9
很多同学知道Cas9, 并不知道还有Cas1,Cas2,Cas etc还有很多蛋白。
2012年突破终于来了，Jennifer A. Doudna（<font>mark for 八卦，最年轻的女院士，女神 etc</font>）和Emmanuelle Charpentier的这篇Science发现了一个比较简单的CRISPR（TypeII）系统的机理。这一系统就简单多了，一个巨大的160KD的蛋白Cas9利用RNA, 就可以完成识别和切割靶向的DNA。他们发现了
1） Type II CRISPR系统中的Cas9是个核酸酶，这个核酸酶结合两个RNA(crRNA, tracrRNA)就可以切割双链DNA.
2） 同时，他们进一步阐明了RNA和目标DNA配对的原则，同时将crRNA-tracrRNA连接成了chimera RNA，这样只需要Cas9蛋白和一条定制的RNA就可以编辑性的DNA。
3） 同时他们进一步分析了Cas9作为核酸酶的活性位点：连个核酸酶活性分别切割靶DNA的两条链。
所有这些工作为现在的风生水起的CRISPR/Cas9的应用奠定了最根本的基础。到这里，大家都知道这个新的基因编辑系统即将呼之欲出了。
<center> </center> 五：真核系统的应用
几乎同时，三个研究组发表三篇论文，两篇在《科学》杂志，一篇在《Elife》上报告了他们在哺乳动物细胞的应用。这就是拼人力、物力和效率来了（所以，可以跟科技部的领导说说，国内要发展绿色通道，开发自己的试剂，留住自己的人才，假设我们同时开始做这个课题，国外文章发了，我们还在等抗体）。核心思想早就在那里了，主要改进大家都一样，
1） 优化密码子，让Cas9蛋白可以在哺乳动物系统中很好的表达。
2） 加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细胞核内进行基因组编辑。
3） 当然，同时需要表达一个guide RNA，把Cas9定位到靶DNA处。
<center> 用这个技术，就可以很方便高效廉价地在细胞上做基因编辑：包括敲除、修改、插入。</center> <center> </center> 六：进一步用Nickase增加编辑特异性
因为Cas9介导的靶向主要依赖于guide RNA和目标DNA20左右的碱基的配对，大家开始重视脱靶效应（off-target）。一系列的研究表明，这种方法的脱靶效应是广泛存在的。这很好理解，因为RNA-DNA的配对不是那么完美的。很快，MIT的张峰在Cell上发表了Double Nick的方法（当然同时也有很多人做，后面陆续也有不少组都有文章）。文章的原理很简单，其实早在2012那篇奠定基础的《科学》文章里就已经埋下了种子。Cas9会在目标DNA上切两刀，如果把其中一个核酸酶活性位点突变掉，它就变成了一个切口酶。用两对这样的sgRNA把这种切口酶带到基因组上的特异位点，这样就大大提高了靶向的特异性。
http://blog.sina.com.cn/s/blog_12d8810790101ho5s.html
一、CRISPR系统的发现-从细菌的获得性免疫说起
CRISPR系统实际是细菌的一种获得性免疫系统。细菌被phage侵染之后，可以获得phage的DNA片段整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，从对phage形成免疫。
1） 早在1987年，日本人在大肠杆菌中发现有串联间隔重复序列。但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。2002年才正式命名为CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).
2） 随着测序技术和生物信息学的发展，2005年，三个研究组同时发现间隔序列（图中红色箭头所示）和侵染细菌的病毒或phage高度同源。从而推测，这一系统可能是类似于siRNA一样，是细菌抵抗Phage的一种机理。
（这些和植物的siRNA, 高等动物的获得性免疫一样，都是获取入侵病毒的一个片段形成记忆，从而再次遭到入侵时可以对抗入侵的一种方式）
这中间还有很多故事（<font>mark先，待补充，还有adaptation的过程的发现</font>），比如，
1） Phage上和CRISPR重复序列同源的序列突变后，Phage又可以重新可以侵染细菌。这显示在这一系统的工作过程中存在着一个序列配对机制。
2） 有些Cas蛋白突变后，细菌还可以获得入侵的DNA片段整合进基因组，但不能降解外源的DNA片段。这证明Cas系统中有的蛋白负责获取并整合外源DNA片段，而另一些酶负责在再次入侵时降解外源DNA。
3） 在Cas9功能不清楚时，其实就发现这个基因上的某些点突变可以导致整个系统不work。等Cas9的核酸酶的身份揭晓时，再回去看以前的数据，一切都豁然开朗了。这些突变恰恰就是Cas9核酸酶的活性位点。
二：谜团逐渐解开-从嗜热链球菌说起
2007年Science上又发表了一篇文章，作者是DANISCO公司的科学家，讲的是关于Streptococcus Thermophilus（嗜热链球菌），这个菌大家可能不熟悉，但他们的产品大家可能天天吃。这是工业上生产酸奶的菌种。工业生产中常遇到的问题就是这些乳酸菌会被Phage侵染，因此这些食品生产企业需要开发各种抗Phage的策略和分离抗phage的菌株，研究也发现抗Phage的菌株和敏感的菌株在CRIPSR的这些位点有差别，前面也讲到其他研究组发现CRISPR中间的重复序列和Phage的序列高度同源。于是，他们就想看一看通过增加和敲除CRISPR位点中间的重复序列是不是可以调节乳酸菌对Phage的敏感性。果然，实验结果正如他们所料。
随着研究的进一步深入，大家逐渐地意识到，细菌抵抗外界入侵的流程大致如上图所示，Cas位点编码多个核酸酶和解旋酶，他们把入侵的DNA切割，整合到CRISPR的重复序列中，形成记忆。当再次遭到入侵时，转录出RNA，Cas蛋白复合物利用这些和入侵的DNA同源的RNA去切割摧毁外源的DNA。
三：Type I and Type III CRISPR系统
随后对不同的菌的基因组测序及其他研究工作的积累，也使得CRIPSR的机理逐渐清晰。越来越多的不同菌中的CRISPR系统被发现，随后研究者们根据他们降解外源的遗传物质的方法，将他们分为了三类。如图中的Type I and Type III. 这两套系统由于参与的蛋白众多，需要几个复合物共同作用才能发挥作用，使得它不宜操作和改造。但其他几个系统的发现的过程也是非常值得一讲的，都是非常漂亮的工作。（<font>mark先，</font><font>待补充</font>）
四：窗户纸就快捅破了-Cas9
很多同学知道Cas9, 并不知道还有Cas1,Cas2,Cas etc还有很多蛋白。
2012年突破终于来了，Jennifer A. Doudna（<font>mark for 八卦，最年轻的女院士，女神 etc</font>）和Emmanuelle Charpentier的这篇Science发现了一个比较简单的CRISPR（TypeII）系统的机理。这一系统就简单多了，一个巨大的160KD的蛋白Cas9利用RNA, 就可以完成识别和切割靶向的DNA。他们发现了
1） Type II CRISPR系统中的Cas9是个核酸酶，这个核酸酶结合两个RNA(crRNA, tracrRNA)就可以切割双链DNA.
2） 同时，他们进一步阐明了RNA和目标DNA配对的原则，同时将crRNA-tracrRNA连接成了chimera RNA，这样只需要Cas9蛋白和一条定制的RNA就可以编辑性的DNA。
3） 同时他们进一步分析了Cas9作为核酸酶的活性位点：连个核酸酶活性分别切割靶DNA的两条链。
所有这些工作为现在的风生水起的CRISPR/Cas9的应用奠定了最根本的基础。到这里，大家都知道这个新的基因编辑系统即将呼之欲出了。
<center> </center> 五：真核系统的应用
几乎同时，三个研究组发表三篇论文，两篇在《科学》杂志，一篇在《Elife》上报告了他们在哺乳动物细胞的应用。这就是拼人力、物力和效率来了（所以，可以跟科技部的领导说说，国内要发展绿色通道，开发自己的试剂，留住自己的人才，假设我们同时开始做这个课题，国外文章发了，我们还在等抗体）。核心思想早就在那里了，主要改进大家都一样，
1） 优化密码子，让Cas9蛋白可以在哺乳动物系统中很好的表达。
2） 加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细胞核内进行基因组编辑。
3） 当然，同时需要表达一个guide RNA，把Cas9定位到靶DNA处。
<center> 用这个技术，就可以很方便高效廉价地在细胞上做基因编辑：包括敲除、修改、插入。</center> <center> </center> 六：进一步用Nickase增加编辑特异性
因为Cas9介导的靶向主要依赖于guide RNA和目标DNA20左右的碱基的配对，大家开始重视脱靶效应（off-target）。一系列的研究表明，这种方法的脱靶效应是广泛存在的。这很好理解，因为RNA-DNA的配对不是那么完美的。很快，MIT的张峰在Cell上发表了Double Nick的方法（当然同时也有很多人做，后面陆续也有不少组都有文章）。文章的原理很简单，其实早在2012那篇奠定基础的《科学》文章里就已经埋下了种子。Cas9会在目标DNA上切两刀，如果把其中一个核酸酶活性位点突变掉，它就变成了一个切口酶。用两对这样的sgRNA把这种切口酶带到基因组上的特异位点，这样就大大提高了靶向的特异性。
http://blog.sina.com.cn/s/blog_12d8810790101ho5s.html
