基于胚胎干细胞同源重组的基因敲除技术

器材：

①培养皿、96 孔板

②显微镜

③离心机

④37 ℃，5％CO₂ 培养箱

⑤FACS9 流式细胞分析仪

⑥电转仪

⑦显微注射仪

试剂：

①293 FT 细胞

②pH7.4 的 MilliQ 水、10％ 甘油、含有钙／镁离子 PBS

③ES-DMEM

④M2 培养液、M16 培养液、氨苄西林、卡那霉素 LB 琼脂板

⑤Trypsin／EDTA

⑥胰酶-EDTA 溶液

⑦Hanks 平衡液

⑧10％FBS-DMEM

基于胚胎干细胞同源重组的基因敲除技术的主要操作步骤简述如下：

（一）基因打靶载体的构建

（1）BAC 的提取：BAC 的提取与普通质粒提取基本相同，唯一需注意的是 BAC 较大，操作时应轻柔避免破坏其完整性，详见本篇第一章第四节。

（2）电转感受态细菌的制备及 BAC（最好为新鲜抽提产物）电转

1）接种单克隆 EL350／EL250 至 3 mLLB 培养基中，32 ℃ 240 r／min 培养 12～16 小时。

2）第 2 天，将过夜菌液 1 mL 接种到 50 mLLB 培养基，32 ℃ 240 r／min 培养 2～3 小时至 OD600 为 0.5～0.7。

3）（如只转 BAC 而不进行同源重组，此步省略）将 10 mL 菌液分装到 200 mL 锥形瓶，置于 42 ℃ 水浴摇床中（约 40 r／min）保温 15 分钟。

4）将锥形瓶置于冰上 20 分钟，此间将 pH7.4 的 MilliQ 水或者用 10％ 甘油，以及电转杯，离心管置于冰上预冷。

5）于 4 ℃ 离心机 3500 r／min 离心 5 分钟将菌液沉淀。

6）以 1 mL 冰水将菌体轻轻重悬，3500 r／min 离心 5 分钟，倒掉上清；重复此步骤 3 次。

7）倒掉上清，余下约 50 μl 用以悬浮菌体。

8）将此感受态细菌与 100～400 ng DNA（必须溶于 MilliQ）混合并转入预冷的 0.1 cm 电转杯中，置于冰上准备转化。

9）设置电转仪，1.75 kV，25 μF，200 Ω，进行电转。

10）电击后，迅速加入 500 μl SOC 并于 32 ℃ 保温 30 分钟；将菌液均匀涂在相应的 LB 琼脂板上，于 32 ℃ 保温 12～20 小时。

（3）PCR 嵌合引物设计及 PCR 纯化：以 5＇---同源臂序列＋扩增引物----3＇的模式设计引物。PLoxp 引物以 pl452 质粒为模板，用于扩增两端各长～80 bp（60～70 即可，总之尽量保证总长不过百）同源序列的 Loxp-NEO／Kan-Loxp 片段；而引物 Pfrt 以 pl451 质粒为模板，用来扩增两端各长～80 bp 同源序列的 FRT-NEO／Kan-FRT 片段。

注意：用作模板的 pl451，pl452 需要酶切线性化，否则胶回收时质粒容易一起被回收。以上 PCR 产物以及酶切片段均用胶回收法回收纯化。

（4）套取 BAC 中的目的片段：将转入 BAC 的 EL350 制备成电转感受态，同时将线性化的载体 PL253-5＇-3＇ARM 转入其中（100～200 ng／50 μl 感受态菌，不可过多，否则会引入过多未酶切质粒从而造成较高的背景）。电转后的菌用 Amp＋的 LB 板筛选。

（5）插入 Loxp-NEO／Kan-Loxp 片段：将上述含有 PL253-fragment 的 EL350 制备成电转感受态，并将纯化的 Loxp-NEO／Kan-Loxp 片段转入其中（100～200 ng／50 μl 感受态菌）。电转后用 AmpKan＋的 LB 板筛选。

（6）Cre 介导的 Loxp 位点间 NEO 片段的去除

1）将含有 Loxp-NEO／Kan-Loxp 质粒的 EL350 克隆接种到 3 mL LB 培养基（Amp＊Kan＋）中，32 ℃ 240 r／min 培养 12～16 小时。

2）第 2 天，将 1 mL 过夜菌液转入 10 mL LB，32℃ 培养 2～3 小时至 OD600＝0.5。

3）加入 100 μl10％L（＋）-阿拉伯糖，继续培养 1 小时。

4）将菌液稀释后分别涂在氨苄西林和卡那霉素 LB 琼脂板上，32 ℃ 培养过夜。

5）氨苄西林板上的克隆应远远多于卡那霉素板。在前者上挑取几个克隆培养并用 PCR、酶切或测序方法进行验证。

（7）插入 FRT-NEO／Kan-FRT 片段：将整合了第一个 Loxp 的质粒转入 EL350，并制备成电转感受态，同时将纯化的片段 FRT-NEO／Kan-FRT 转入其中（100～200ng／50 μ1 感受态菌）。

（二）胚胎干细胞（ESC）的培养

1．饲养层细胞的制备

（1）取 E12.5～E14.5 小鼠胚胎。置于有 D-hanks 的 10 cm 培养皿中。

（2）去头和内脏后转移剩余部分到一个 10 cm 培养皿盖子中，用灭菌的弯头剪尽量剪碎。

（3）加入 3 mL Trypsin／EDTA。37 ℃ 10 分钟，不断用手晃动。

（4）加入 3 mL 10％FBS-DMEM。37 ℃ 10 分钟，不断用手晃动。

（5）1000 r／min，5 分钟。用移液枪小心吸去上清，允许剩余少量液体。

（6）加入 10 mL 10％FBS-DMEM 重悬。铺到一个 10 cm 培养皿。标记为 MEFs P1。

（7）37 ℃ 培养两天后以 1：3～1：5 传代。标记为 MEFs P2。

（8）37 ℃ 培养两天。冻存 P2（1 皿冻 3 管）。标记为 MEFs P2（冻存液：95％FBS＋5％DMSO）。细胞达到 90％ 汇合，即可进行 MEF 细胞传代，负压吸去培养基，加入 4 mL DPBS，吸去 DPBS，加入 1.5 mL Trypsin／EDTA。37 ℃ 细胞培养箱内放置 3 分钟。加入 4 mL 10％FBS-DMEM 中止 Trypsin 的作用。

（9）转移细胞到 50 mL 离心管中，1000 r／min 离心 3 分钟。负压吸去上清。用 30 mL 10％ FBS-DMEM 重悬细胞。铺到 3 个 10 cm 的培养皿上。待细胞长满后，制备饲养层细胞，负压吸去培养基。加入 10 mL 新鲜的 10％FBS-DMEM 和 10 μg／mL mitomycin C。于 37 ℃ 细胞培养箱内放置 3 小时。

（10）吸去 mitomycin C，如是第一次使用则可以避光储存于 4 ℃ 条件，下次再用；如已是第二次使用则不再保留。加入 10 mL DPBS，吸去 DPBS，重复 3 次。

（11）加入 1.5 mL Trypsin／EDTA。于 37 ℃ 细胞培养箱内放置 5 分钟。加入 4 mL 10％ FBS-DMEM 中止 Trypsin 的作用。

（12）转移细胞到 50 mL 离心管中，1000 r／min 离心 5 分钟。负压吸去上清。30 mL 10％FBS-DMEM 重悬细胞，铺到 3 个用 0.1％gelatin 预处理过的 10 cm 培养皿上，37 ℃ 培养。1 周内使用。

2．ES 细胞复苏

（1）从液氮罐取出一管 ES 细胞，迅速置于 37 ℃ 水浴锅中溶化。

（2）和 2 mL ES-DMEM 一起转移到 15 mL 离心管中。1000 r／min 离心 5 分钟，负压吸去上清。用 ES-DMEM 重悬细胞，铺到 10 cm 的有饲养层的培养皿上。

（3）第二天更换新的 ES-DMEM。

3．ES 细胞传代

（1）负压吸去培养基，加入 5 mL DPBS，吸去 DPBS，加入 1 mL Trypsin／EDTA。

（2）37 ℃ 细胞培养箱内放置 5 分钟。轻轻吹打至单个细胞状态。

（3）加入 4 mL ES-DMEM 中止 Trypsin 的作用。

（4）转移细胞到 50 mL 离心管中，1000 r／min 离心 5 分钟。负压吸去上清。

（5）用 ES-DMEM 重悬细胞，铺到 3 个 10 cm 的有滋养层细胞的培养皿上。

（三）ES 细胞基因转染

1．要电转的 ES 细胞 3 小时左右前换新鲜的 ES-DMEM。负压吸去培养基。加入 5 mL DPBS，吸去 DPBS。加入 1 mL Trypsin／EDTA。37 ℃ 细胞培养箱内放置 5 分钟。轻轻吹打至单个细胞状态。

2．加入 4 mL ES-DMEM 中止 Trypsin 的作用。转移细胞到 50 mL 离心管中。

3．用 Ca₂／Mg＊free PBS 20 mL 定容至 30 mL，计数。1000 r／min 离心 5 分钟，负压吸去上清（电转所需细胞浓度为 1x10cells／mL）。

4．取 0.8 mL 的 Ca₂／Mg₂ free PBS 细胞悬液，加到 0.4 cm 宽度的电转杯中，加入 25 μg 线性化的质粒，混匀。室温放置 5 分钟。

5.240 V 500 μF 电转。室温放置 5 分钟。与 20 mL 的 ES-DMEM 混匀，铺到 2 个 10 cm 的有饲养层细胞的培养皿上，不加任何筛选药物。

（四）基因敲除阳性 ES 细胞克隆的筛选

1．ES 克隆的挑选

（1）准备 2 个 96 孔板，其中一个铺有饲养层细胞，加入 200 μl ES 筛选培养基，另一个加入 10 μl 含有钙／镁离子 PBS。

（2）吸去培养基，含有钙／镁离子的 PBS 洗一次，再加入 10 mL 含有钙／镁离子 PBS，置于体式镜下，用吸管轻轻在要挑取的克隆周围切割一圈，吸去单克隆并置于事先准备好的含有 10 μl PBS 的 96 孔板中，重复此步骤直到吸去 48 个克隆，然后吸去 PBS，加入 10 mL ES 培养基，置于培养箱内继续培养。

（3）另取一盘克隆，重复步骤（2）完成 96 个克隆的挑取。

（4）每孔加入 25 μl tyipsin／EDTA，37 ℃ 消化 5 分钟，80 μl ES 筛选培养基，终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，转移至铺有 feeder 的 96 孔板，继续培养，待细胞 80％ 汇合的时候进行传代。

2.96 孔板细胞传代

（1）准备 3 个 96 孔板，其中两个铺有饲养层细胞，一个仅铺有 0.1％ 的明胶用于 DNA 提取。

（2）吸去培养基，每孔加入 25 μl tyipsin／EDTA 37 ℃ 消化 5 分钟，加入 120 μl ES 筛选培养基，终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，分到 3 个事先准备好的 96 孔板中。

（3）第二天换液。

3.96 孔板细胞冻存

（1）吸去培养基，DPBS 洗一次，每孔加入 25 μl tyipsin／EDTA 37 ℃ 消化 5 分钟，加入 80 μl ES 培养基，终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。

（2）每孔加入 100 μl 预冷的细胞冻存液（60％ES-DMEM，20％FBS，20％DMSO），轻轻混匀。

（3）每孔加入 50 μl 预冷的除菌矿物油，封口膜将四周密封好，并作详细标记。

（4）将标记好的 96 孔板放入预冷的泡沫盒中，-80 ℃ 保存。

4.96 孔板 ES 细胞 DNA 提取

（1）在 0.1％gelatin coated 的 96 孔板上的 ES 细胞长 4～5 天后就可以用于提 DNA。

（2）负压吸去培养基，加入 DPBS（每孔 200 μl）洗两次，注意不要将细胞冲起来。每孔加入 50ul lysisbuffer（lysis buffer 在使用前加入 1 mg／mL Proteinase K），55 ℃ 湿盒静置 48 小时。

（3）小心地在每孔滴加 100 μl NaCl-乙醇（150 μl 5mol／L NaCl 加到 10 mL 预冷的 100％ 乙醇）。室温静置 5 小时。

（4）小心地倒扣 96 孔板到吸水纸上（如果看到漂浮的 DNA，则只能用枪一孔一孔地吸。下同）。

（5）小心地在每孔滴加 150 μl70％ 乙醇，倒扣在吸水纸上，共洗 3 次。倒扣 96 孔板，室温干燥 1～2 小时。

（6）加入 1xTE（每孔 30 μl），用封口膜将 96 孔板密封好，防止液体蒸发，静置 24 小时后，即可用于 PCR 检测（如果不立即检测，可放于-20 ℃ 储存）。

5．阳性克隆扩增

（1）从-80 ℃ 取出正确同源重组克隆所在的 96 孔板。在 37 ℃ 培养箱里迅速复温到冰几乎全化。

（2）用 70％ 乙醇擦拭外表面。

（3）转移正确同源重组克隆到一个铺有饲养层细胞的 24 孔板，第二天换液。

（4）当 ES 细胞长到 80％～90％ 时，转移到两个铺有饲养层细胞的 6 孔板。注意换液。

（5）当 ES 细胞长到 80％～90％ 时，转移到两个铺有饲养层细胞的 10 cm 细胞培养皿。注意换液。

（6）ES 细胞长到 80％～90％ 时，其中一个 10 cm 细胞培养皿中的细胞用于冻存，另一个继续培养 2～3 天用于基因组 DNA 提取并进行 southern blot 检测以确定正确同源重组。

（7）将正确的 ES 细胞克隆扩增用于后续的囊胚注射，然后进行假孕母鼠子宫移植，以获得嵌合小鼠。

（五）嵌合体的获得

1．超数排卵

2．交配并检栓

（1）受精卵供体鼠：打完 HCG 后的雌鼠立即放入笼中与公鼠交配，次日晨检阴栓。将见栓鼠作好见栓记录（见栓 0.5 天，我们在第 6 天上午取见栓 2.5 天即 8 细胞期的胚胎）。

（2）假孕母鼠：第 5 天下午取 6 周龄以上（＞20 g）的母鼠与结扎公鼠合笼交配，第 6 天上午检栓方法同供体鼠。将见栓鼠作好见栓记录（当天为见栓 0.5 天，我们在第 8 天下午即见栓 2.5 天移植囊胚用）。

3．获取 8 细胞期的胚胎 第 6 天上午断颈处死见栓 2.5 天供体鼠，用 70％ 乙醇将其背部打湿，在背部靠尾端用镊子拎起皮肤，剪刀剪出一个横切口，用镊子夹住切口处的皮肤向头侧剥开，暴露背侧腰部的肌肉，用小剪刀在此处开一小口，用镊子夹住体内卵巢上的脂肪堆，将其拖出体外，再用镊子夹住子宫，取输卵管及子宫中上部放入预先准备好的 M2（或 D-PBS）液滴中。用针头插入输卵管伞部，冲洗整个输卵管及子宫中上部。收集胚胎并将卵子放入预先准备好的 M2（或 D-PBS）液滴中洗涤干净，洗去血细胞及残渣等，将洗好的胚胎转移到覆盖有矿物油的 M16 液滴中，再放入 5％CO₂、37 ℃ 培养箱中培养两天至囊胚期。

4．囊胚注射

（1）准备 100～200 μl ES-medium 的液滴均分 3～4 滴在 3.5 cm Petri 培养皿并覆盖矿物油，于 5％CO₂、37 ℃ 培养箱中放置。

（2）准备 100 μl 注射缓冲液（injection medium）（ES-medium＋Hepes＋2 μl DNase I），在 3.5 cm Petri 培养皿中做约 2 mm 的液滴，用移卵管将 15 枚左右的胚胎和 ES 细胞加入此操作液滴并覆盖矿物油，放入 4 ℃ 冰箱预冷（防止贴壁）。

（3）将持卵针和注射针装入显微注射仪，并通过操控显微注射仪将注射针置于操作液滴里。

（4）用注射针挑选一些小而亮且边缘比较光滑的 ES 细胞 10～15 个。

（5）用持卵针将胚胎固定，使内细胞团固定在 6 点或 12 点的位置，并将针移到视野中央，调整注射针使之在同一平面上。

（6）轻微用注射针转动胚胎，寻找细胞间隙处进针，反复快速地戳几次进针处直至注射针插入。这样一方面进针容易，另外对胚胎损伤较小。

（7）注射针进入囊腔后，轻轻将 ES 细胞吹入囊腔。

（8）注射结束后，退针动作要轻微，防止胚胎内压过高将注入的 ES 细胞压出。

（9）将注射 ES 细胞的囊胚移入 ES-medium 中培养，恢复 4～6 小时（囊胚腔会重新鼓起）。

除囊胚注射外，近年来 8-细胞期注射技术逐渐进入人们的视野。8-细胞期注射，是指将经过修饰的 ES 细胞通过显微注射的方式导入到透明带内，然后再将这种嵌合的胚胎移植。其基本操作是，用激光或者其他技术在 8-细胞期胚胎的透明带上打开一个小孔，用注射针将 ES 细胞由此小孔处导入。该技术的优势在于其产生的 F0 代小鼠几乎可以达到 100％ 的种系遗传，这可能是因为处于发育较成熟阶段的 ES 细胞快速夺取发育主动权的结果。虽然该技术操作较为复杂，但其具有广阔的应用前景。

5．子宫胚胎移植 移植到第 6 天见栓受体子宫内，每只受体约移植 15 枚胚胎（两侧移植以增加妊娠）。

（1）子宫移植操作步骤：将小鼠置于敞口超净台中，1％ 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉、剪毛、70％ 乙醇消毒皮肤；背部近中线处，最后肋骨水平上，纵向切开皮肤、腹壁，在白色脂肪体上方开一小口剪开腹膜，用钝镊子夹住脂肪体，从切口拉出，继之卵巢、输卵管、子宫相继被拉出，并小心地移入体视显微镜下。

（2）准备移植胚胎：用硬玻璃毛细管制作直径 150～200 μm 的移植管，先在移植管中加入液体石蜡至肩部，然后吸入一个小气泡，再吸入培养液，之后紧跟着一个泡。在吸管的末端约 0.5 cm 长时，吸入 15 枚胚胎及少许培养液。将装入胚胎的移植管固定在体视显微镜上的一个固定装置上，避免振动和触及它。

（3）胚胎的子宫移植：用钝镊子轻轻夹住子宫上端，并用针头在其下的子宫壁上扎一小孔。注意避开血管，并保证针扎入子宫腔内而不是子宫壁中。轻轻拔出针头，沿该孔将移植管插入约 0.5 cm，轻轻吹吸管，使胚胎移入子宫内。子宫卵巢输卵管推回腹腔，复位，缝合，70％ 乙醇消毒皮肤一次。

（4）复苏：将做完移植手术的小鼠放回笼子，将笼子放在热台上保温。把热台的温度设为 37 ℃。直到小鼠苏醒，把小鼠送回动物房。

（六）基因敲除纯合子的获得

经过逐代回交，我们可以得到纯遗传背景的杂合子小鼠，然后通过杂合子之间的杂交来得到纯合子小鼠。根据孟德尔遗传规律，子代中就可以出现 25％ 的纯合子小鼠。这可以通过 PCR 的方法加以鉴定筛选。

（七）基因敲除小鼠的表型分析