提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

基于胚胎干细胞同源重组的基因敲除技术

相关实验:基于胚胎干细胞同源重组的基因敲除技术

最新修订时间:

简介

同源重组是遗传重组的一种类型,是指两条相似或相同的 DNA 链之间发生核酸序列的交换而引起 DNA 重新排列。这个过程包括 DNA 的断裂和重新连接等若干步骤。尽管同源重组常常对 DNA 双链的断裂起到修补的作用,但其也会介导减数分裂时染色体交换而产生重组 DNA。这些由于同源重组而产生的突变,是生物体适应环境变化的一种有效方式。
基因敲除(gene knock-out)是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术,是一种定向改变细胞或者个体遗传信息的实验方法。它的产生和发展是建立在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES 细胞)技术和同源重组技术的基础之上的。

材料与仪器

器材:


①培养皿、96 孔板


②显微镜


③离心机


④37 ℃,5%CO2 培养箱


⑤FACS9 流式细胞分析仪


⑥电转仪


⑦显微注射仪


试剂:


①293 FT 细胞


②pH7.4 的 MilliQ 水、10% 甘油、含有钙/镁离子 PBS


③ES-DMEM


④M2 培养液、M16 培养液、氨苄西林、卡那霉素 LB 琼脂板


⑤Trypsin/EDTA


⑥胰酶-EDTA 溶液


⑦Hanks 平衡液


⑧10%FBS-DMEM


⑨冻存液:95%FBS+5%DMSO、液氮

步骤

基于胚胎干细胞同源重组的基因敲除技术的主要操作步骤简述如下:


(一)基因打靶载体的构建

(1)BAC 的提取:BAC 的提取与普通质粒提取基本相同,唯一需注意的是 BAC 较大,操作时应轻柔避免破坏其完整性,详见本篇第一章第四节。


(2)电转感受态细菌的制备及 BAC(最好为新鲜抽提产物)电转


1)接种单克隆 EL350/EL250 至 3 mLLB 培养基中,32 ℃ 240 r/min 培养 12~16 小时。


2)第 2 天,将过夜菌液 1 mL 接种到 50 mLLB 培养基,32 ℃ 240 r/min 培养 2~3 小时至 OD600 为 0.5~0.7。


3)(如只转 BAC 而不进行同源重组,此步省略)将 10 mL 菌液分装到 200 mL 锥形瓶,置于 42 ℃ 水浴摇床中(约 40 r/min)保温 15 分钟。


4)将锥形瓶置于冰上 20 分钟,此间将 pH7.4 的 MilliQ 水或者用 10% 甘油,以及电转杯,离心管置于冰上预冷。


5)于 4 ℃ 离心机 3500 r/min 离心 5 分钟将菌液沉淀。


6)以 1 mL 冰水将菌体轻轻重悬,3500 r/min 离心 5 分钟,倒掉上清;重复此步骤 3 次。


7)倒掉上清,余下约 50 μl 用以悬浮菌体。


8)将此感受态细菌与 100~400 ng DNA(必须溶于 MilliQ)混合并转入预冷的 0.1 cm 电转杯中,置于冰上准备转化。


9)设置电转仪,1.75 kV,25 μF,200 Ω,进行电转。


10)电击后,迅速加入 500 μl SOC 并于 32 ℃ 保温 30 分钟;将菌液均匀涂在相应的 LB 琼脂板上,于 32 ℃ 保温 12~20 小时。


(3)PCR 嵌合引物设计及 PCR 纯化:以 5'---同源臂序列+扩增引物----3'的模式设计引物。PLoxp 引物以 pl452 质粒为模板,用于扩增两端各长~80 bp(60~70 即可,总之尽量保证总长不过百)同源序列的 Loxp-NEO/Kan-Loxp 片段;而引物 Pfrt 以 pl451 质粒为模板,用来扩增两端各长~80 bp 同源序列的 FRT-NEO/Kan-FRT 片段。


注意:用作模板的 pl451,pl452 需要酶切线性化,否则胶回收时质粒容易一起被回收。以上 PCR 产物以及酶切片段均用胶回收法回收纯化。


(4)套取 BAC 中的目的片段:将转入 BAC 的 EL350 制备成电转感受态,同时将线性化的载体 PL253-5'-3'ARM 转入其中(100~200 ng/50 μl 感受态菌,不可过多,否则会引入过多未酶切质粒从而造成较高的背景)。电转后的菌用 Amp+的 LB 板筛选。


(5)插入 Loxp-NEO/Kan-Loxp 片段:将上述含有 PL253-fragment 的 EL350 制备成电转感受态,并将纯化的 Loxp-NEO/Kan-Loxp 片段转入其中(100~200 ng/50 μl 感受态菌)。电转后用 AmpKan+的 LB 板筛选。


(6)Cre 介导的 Loxp 位点间 NEO 片段的去除


1)将含有 Loxp-NEO/Kan-Loxp 质粒的 EL350 克隆接种到 3 mL LB 培养基(Amp*Kan+)中,32 ℃ 240 r/min 培养 12~16 小时。


2)第 2 天,将 1 mL 过夜菌液转入 10 mL LB,32℃ 培养 2~3 小时至 OD600=0.5。


3)加入 100 μl10%L(+)-阿拉伯糖,继续培养 1 小时。


4)将菌液稀释后分别涂在氨苄西林和卡那霉素 LB 琼脂板上,32 ℃ 培养过夜。


5)氨苄西林板上的克隆应远远多于卡那霉素板。在前者上挑取几个克隆培养并用 PCR、酶切或测序方法进行验证。


(7)插入 FRT-NEO/Kan-FRT 片段:将整合了第一个 Loxp 的质粒转入 EL350,并制备成电转感受态,同时将纯化的片段 FRT-NEO/Kan-FRT 转入其中(100~200ng/50 μ1 感受态菌)。


(二)胚胎干细胞(ESC)的培养

1.饲养层细胞的制备


(1)取 E12.5~E14.5 小鼠胚胎。置于有 D-hanks 的 10 cm 培养皿中。


(2)去头和内脏后转移剩余部分到一个 10 cm 培养皿盖子中,用灭菌的弯头剪尽量剪碎。


(3)加入 3 mL Trypsin/EDTA。37 ℃ 10 分钟,不断用手晃动。


(4)加入 3 mL 10%FBS-DMEM。37 ℃ 10 分钟,不断用手晃动。


(5)1000 r/min,5 分钟。用移液枪小心吸去上清,允许剩余少量液体。


(6)加入 10 mL 10%FBS-DMEM 重悬。铺到一个 10 cm 培养皿。标记为 MEFs P1。


(7)37 ℃ 培养两天后以 1:3~1:5 传代。标记为 MEFs P2。


(8)37 ℃ 培养两天。冻存 P2(1 皿冻 3 管)。标记为 MEFs P2(冻存液:95%FBS+5%DMSO)。细胞达到 90% 汇合,即可进行 MEF 细胞传代,负压吸去培养基,加入 4 mL DPBS,吸去 DPBS,加入 1.5 mL Trypsin/EDTA。37 ℃ 细胞培养箱内放置 3 分钟。加入 4 mL 10%FBS-DMEM 中止 Trypsin 的作用。


(9)转移细胞到 50 mL 离心管中,1000 r/min 离心 3 分钟。负压吸去上清。用 30 mL 10% FBS-DMEM 重悬细胞。铺到 3 个 10 cm 的培养皿上。待细胞长满后,制备饲养层细胞,负压吸去培养基。加入 10 mL 新鲜的 10%FBS-DMEM 和 10 μg/mL mitomycin C。于 37 ℃ 细胞培养箱内放置 3 小时。


(10)吸去 mitomycin C,如是第一次使用则可以避光储存于 4 ℃ 条件,下次再用;如已是第二次使用则不再保留。加入 10 mL DPBS,吸去 DPBS,重复 3 次。


(11)加入 1.5 mL Trypsin/EDTA。于 37 ℃ 细胞培养箱内放置 5 分钟。加入 4 mL 10% FBS-DMEM 中止 Trypsin 的作用。


(12)转移细胞到 50 mL 离心管中,1000 r/min 离心 5 分钟。负压吸去上清。30 mL 10%FBS-DMEM 重悬细胞,铺到 3 个用 0.1%gelatin 预处理过的 10 cm 培养皿上,37 ℃ 培养。1 周内使用。


2.ES 细胞复苏


(1)从液氮罐取出一管 ES 细胞,迅速置于 37 ℃ 水浴锅中溶化。


(2)和 2 mL ES-DMEM 一起转移到 15 mL 离心管中。1000 r/min 离心 5 分钟,负压吸去上清。用 ES-DMEM 重悬细胞,铺到 10 cm 的有饲养层的培养皿上。


(3)第二天更换新的 ES-DMEM。


3.ES 细胞传代


(1)负压吸去培养基,加入 5 mL DPBS,吸去 DPBS,加入 1 mL Trypsin/EDTA。


(2)37 ℃ 细胞培养箱内放置 5 分钟。轻轻吹打至单个细胞状态。


(3)加入 4 mL ES-DMEM 中止 Trypsin 的作用。


(4)转移细胞到 50 mL 离心管中,1000 r/min 离心 5 分钟。负压吸去上清。


(5)用 ES-DMEM 重悬细胞,铺到 3 个 10 cm 的有滋养层细胞的培养皿上。


(三)ES 细胞基因转染

1.要电转的 ES 细胞 3 小时左右前换新鲜的 ES-DMEM。负压吸去培养基。加入 5 mL DPBS,吸去 DPBS。加入 1 mL Trypsin/EDTA。37 ℃ 细胞培养箱内放置 5 分钟。轻轻吹打至单个细胞状态。


2.加入 4 mL ES-DMEM 中止 Trypsin 的作用。转移细胞到 50 mL 离心管中。


3.用 Ca2/Mg*free PBS 20 mL 定容至 30 mL,计数。1000 r/min 离心 5 分钟,负压吸去上清(电转所需细胞浓度为 1x10cells/mL)。


4.取 0.8 mL 的 Ca2/Mg2 free PBS 细胞悬液,加到 0.4 cm 宽度的电转杯中,加入 25 μg 线性化的质粒,混匀。室温放置 5 分钟。


5.240 V 500 μF 电转。室温放置 5 分钟。与 20 mL 的 ES-DMEM 混匀,铺到 2 个 10 cm 的有饲养层细胞的培养皿上,不加任何筛选药物。


(四)基因敲除阳性 ES 细胞克隆的筛选

1.ES 克隆的挑选


(1)准备 2 个 96 孔板,其中一个铺有饲养层细胞,加入 200 μl ES 筛选培养基,另一个加入 10 μl 含有钙/镁离子 PBS。


(2)吸去培养基,含有钙/镁离子的 PBS 洗一次,再加入 10 mL 含有钙/镁离子 PBS,置于体式镜下,用吸管轻轻在要挑取的克隆周围切割一圈,吸去单克隆并置于事先准备好的含有 10 μl PBS 的 96 孔板中,重复此步骤直到吸去 48 个克隆,然后吸去 PBS,加入 10 mL ES 培养基,置于培养箱内继续培养。


(3)另取一盘克隆,重复步骤(2)完成 96 个克隆的挑取。


(4)每孔加入 25 μl tyipsin/EDTA,37 ℃ 消化 5 分钟,80 μl ES 筛选培养基,终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液,转移至铺有 feeder 的 96 孔板,继续培养,待细胞 80% 汇合的时候进行传代。


2.96 孔板细胞传代


(1)准备 3 个 96 孔板,其中两个铺有饲养层细胞,一个仅铺有 0.1% 的明胶用于 DNA 提取。


(2)吸去培养基,每孔加入 25 μl tyipsin/EDTA 37 ℃ 消化 5 分钟,加入 120 μl ES 筛选培养基,终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液,分到 3 个事先准备好的 96 孔板中。


(3)第二天换液。


3.96 孔板细胞冻存


(1)吸去培养基,DPBS 洗一次,每孔加入 25 μl tyipsin/EDTA 37 ℃ 消化 5 分钟,加入 80 μl ES 培养基,终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。


(2)每孔加入 100 μl 预冷的细胞冻存液(60%ES-DMEM,20%FBS,20%DMSO),轻轻混匀。


(3)每孔加入 50 μl 预冷的除菌矿物油,封口膜将四周密封好,并作详细标记。


(4)将标记好的 96 孔板放入预冷的泡沫盒中,-80 ℃ 保存。


4.96 孔板 ES 细胞 DNA 提取


(1)在 0.1%gelatin coated 的 96 孔板上的 ES 细胞长 4~5 天后就可以用于提 DNA。


(2)负压吸去培养基,加入 DPBS(每孔 200 μl)洗两次,注意不要将细胞冲起来。每孔加入 50ul lysisbuffer(lysis buffer 在使用前加入 1 mg/mL Proteinase K),55 ℃ 湿盒静置 48 小时。


(3)小心地在每孔滴加 100 μl NaCl-乙醇(150 μl 5mol/L NaCl 加到 10 mL 预冷的 100% 乙醇)。室温静置 5 小时。


(4)小心地倒扣 96 孔板到吸水纸上(如果看到漂浮的 DNA,则只能用枪一孔一孔地吸。下同)。


(5)小心地在每孔滴加 150 μl70% 乙醇,倒扣在吸水纸上,共洗 3 次。倒扣 96 孔板,室温干燥 1~2 小时。


(6)加入 1xTE(每孔 30 μl),用封口膜将 96 孔板密封好,防止液体蒸发,静置 24 小时后,即可用于 PCR 检测(如果不立即检测,可放于-20 ℃ 储存)。


5.阳性克隆扩增


(1)从-80 ℃ 取出正确同源重组克隆所在的 96 孔板。在 37 ℃ 培养箱里迅速复温到冰几乎全化。


(2)用 70% 乙醇擦拭外表面。


(3)转移正确同源重组克隆到一个铺有饲养层细胞的 24 孔板,第二天换液。


(4)当 ES 细胞长到 80%~90% 时,转移到两个铺有饲养层细胞的 6 孔板。注意换液。


(5)当 ES 细胞长到 80%~90% 时,转移到两个铺有饲养层细胞的 10 cm 细胞培养皿。注意换液。


(6)ES 细胞长到 80%~90% 时,其中一个 10 cm 细胞培养皿中的细胞用于冻存,另一个继续培养 2~3 天用于基因组 DNA 提取并进行 southern blot 检测以确定正确同源重组。


(7)将正确的 ES 细胞克隆扩增用于后续的囊胚注射,然后进行假孕母鼠子宫移植,以获得嵌合小鼠。


(五)嵌合体的获得

1.超数排卵


2.交配并检栓


(1)受精卵供体鼠:打完 HCG 后的雌鼠立即放入笼中与公鼠交配,次日晨检阴栓。将见栓鼠作好见栓记录(见栓 0.5 天,我们在第 6 天上午取见栓 2.5 天即 8 细胞期的胚胎)。


(2)假孕母鼠:第 5 天下午取 6 周龄以上(>20 g)的母鼠与结扎公鼠合笼交配,第 6 天上午检栓方法同供体鼠。将见栓鼠作好见栓记录(当天为见栓 0.5 天,我们在第 8 天下午即见栓 2.5 天移植囊胚用)。


3.获取 8 细胞期的胚胎 第 6 天上午断颈处死见栓 2.5 天供体鼠,用 70% 乙醇将其背部打湿,在背部靠尾端用镊子拎起皮肤,剪刀剪出一个横切口,用镊子夹住切口处的皮肤向头侧剥开,暴露背侧腰部的肌肉,用小剪刀在此处开一小口,用镊子夹住体内卵巢上的脂肪堆,将其拖出体外,再用镊子夹住子宫,取输卵管及子宫中上部放入预先准备好的 M2(或 D-PBS)液滴中。用针头插入输卵管伞部,冲洗整个输卵管及子宫中上部。收集胚胎并将卵子放入预先准备好的 M2(或 D-PBS)液滴中洗涤干净,洗去血细胞及残渣等,将洗好的胚胎转移到覆盖有矿物油的 M16 液滴中,再放入 5%CO2、37 ℃ 培养箱中培养两天至囊胚期。


4.囊胚注射


(1)准备 100~200 μl ES-medium 的液滴均分 3~4 滴在 3.5 cm Petri 培养皿并覆盖矿物油,于 5%CO2、37 ℃ 培养箱中放置。


(2)准备 100 μl 注射缓冲液(injection medium)(ES-medium+Hepes+2 μl DNase I),在 3.5 cm Petri 培养皿中做约 2 mm 的液滴,用移卵管将 15 枚左右的胚胎和 ES 细胞加入此操作液滴并覆盖矿物油,放入 4 ℃ 冰箱预冷(防止贴壁)。


(3)将持卵针和注射针装入显微注射仪,并通过操控显微注射仪将注射针置于操作液滴里。


(4)用注射针挑选一些小而亮且边缘比较光滑的 ES 细胞 10~15 个。


(5)用持卵针将胚胎固定,使内细胞团固定在 6 点或 12 点的位置,并将针移到视野中央,调整注射针使之在同一平面上。


(6)轻微用注射针转动胚胎,寻找细胞间隙处进针,反复快速地戳几次进针处直至注射针插入。这样一方面进针容易,另外对胚胎损伤较小。


(7)注射针进入囊腔后,轻轻将 ES 细胞吹入囊腔。


(8)注射结束后,退针动作要轻微,防止胚胎内压过高将注入的 ES 细胞压出。


(9)将注射 ES 细胞的囊胚移入 ES-medium 中培养,恢复 4~6 小时(囊胚腔会重新鼓起)。


除囊胚注射外,近年来 8-细胞期注射技术逐渐进入人们的视野。8-细胞期注射,是指将经过修饰的 ES 细胞通过显微注射的方式导入到透明带内,然后再将这种嵌合的胚胎移植。其基本操作是,用激光或者其他技术在 8-细胞期胚胎的透明带上打开一个小孔,用注射针将 ES 细胞由此小孔处导入。该技术的优势在于其产生的 F0 代小鼠几乎可以达到 100% 的种系遗传,这可能是因为处于发育较成熟阶段的 ES 细胞快速夺取发育主动权的结果。虽然该技术操作较为复杂,但其具有广阔的应用前景。


5.子宫胚胎移植 移植到第 6 天见栓受体子宫内,每只受体约移植 15 枚胚胎(两侧移植以增加妊娠)。


(1)子宫移植操作步骤:将小鼠置于敞口超净台中,1% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉、剪毛、70% 乙醇消毒皮肤;背部近中线处,最后肋骨水平上,纵向切开皮肤、腹壁,在白色脂肪体上方开一小口剪开腹膜,用钝镊子夹住脂肪体,从切口拉出,继之卵巢、输卵管、子宫相继被拉出,并小心地移入体视显微镜下。


(2)准备移植胚胎:用硬玻璃毛细管制作直径 150~200 μm 的移植管,先在移植管中加入液体石蜡至肩部,然后吸入一个小气泡,再吸入培养液,之后紧跟着一个泡。在吸管的末端约 0.5 cm 长时,吸入 15 枚胚胎及少许培养液。将装入胚胎的移植管固定在体视显微镜上的一个固定装置上,避免振动和触及它。


(3)胚胎的子宫移植:用钝镊子轻轻夹住子宫上端,并用针头在其下的子宫壁上扎一小孔。注意避开血管,并保证针扎入子宫腔内而不是子宫壁中。轻轻拔出针头,沿该孔将移植管插入约 0.5 cm,轻轻吹吸管,使胚胎移入子宫内。子宫卵巢输卵管推回腹腔,复位,缝合,70% 乙醇消毒皮肤一次。


(4)复苏:将做完移植手术的小鼠放回笼子,将笼子放在热台上保温。把热台的温度设为 37 ℃。直到小鼠苏醒,把小鼠送回动物房。


(六)基因敲除纯合子的获得

经过逐代回交,我们可以得到纯遗传背景的杂合子小鼠,然后通过杂合子之间的杂交来得到纯合子小鼠。根据孟德尔遗传规律,子代中就可以出现 25% 的纯合子小鼠。这可以通过 PCR 的方法加以鉴定筛选。


(七)基因敲除小鼠的表型分析

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序