丁香实验_LOGO丁香通
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册

同源重组基因敲除糖筛多次均以失败告终

相关实验:基于胚胎干细胞同源重组的基因敲除技术

user-title

dxy_zaczwn58

单交换已经完成,自杀质粒已经进入目标菌株,下一步10%蔗糖糖筛促使菌株进行二次交换,但是筛了好几次,不是没有条带就是断开了同一条链。

wx-share
分享

3 个回答

user-title

loveliufudan

有帮助

以下是一些可能的原因和建议:

1. 检查实验条件:确保使用的蔗糖浓度和培养条件是正确的,因为这些条件对于成功的筛选很关键。确认实验步骤是否准确无误,并且实验室设备正常运行。

2. 自杀质粒的稳定性:检查自杀质粒的构建是否正确,并确保质粒在菌株中的稳定性。可能需要进行额外的验证或优化质粒构建步骤,以确保其稳定性和可靠性。

3. 检查目标序列:确认你的目标序列是否与自杀质粒匹配,并且没有发生不可预料的突变或插入。检查目标序列的完整性,并使用适当的方法验证重组事件的发生。

4. 尝试其他筛选方法:如果蔗糖筛选一直失败,考虑尝试其他筛选方法,如抗生素抗性基因或其他标记基因的筛选。选择适当的筛选方法可能有助于提高成功率。

user-title

沫子大大

有帮助

1.受体细胞的复合体形成情况: 当目标细胞中的复合体形成不充分或不稳定时,同源重组可能会失败,从而导致没有条带或者同一条链断开的情况。2.转化效率低:如果目标细胞的转化效率低,那么同源重组的成功率也会降低,从而导致没有条带或者同一条链断开的情况。3.糖浓度太高或太低: 糖筛的糖浓度太高或太低可能会对细胞产生压力,导致细胞死亡或生长受阻,从而影响筛选结果。4.选时间不足:如果筛选时间不够长,可能会导致一些细胞没有充分生长或没有机会形成所需的突变,并从而导致没有条带或者同-条链断开的情况。

user-title

dxy_zaczwn58user-title

看了一圈就这个回答有道理,请问复合体是什么?我做细菌也会有复合体吗?我已经将蔗糖浓度从10%提升到20%了,依旧没有成功的,温度也试过高温低温,请问多长的培养时间才合适呢

user-title

dxy_mqg1dtg8

有帮助

造成这个情况的可能原因如下:

1. 重组效率低:同源重组是一种复杂的过程,需要多种因素的协同作用。如果重组效率低,可能会导致无法筛选到目标菌株,或者出现断开链的情况。

 

2. 糖筛条件不当:糖筛需要一定的时间和温度条件,如果不当可能会影响筛选效果。例如,糖筛时间过短、温度过高或过低等因素都可能导致筛选失败。

 

3. 质粒质量差:如果自杀质粒的质量不好,可能会影响其在目标菌株中的表达和功能,从而导致筛选失败或者断开链的情况。

 

4. 目标基因序列不稳定:如果目标基因序列不稳定,可能会出现断开链的情况。此时,需要考虑使用其他筛选方法,如PCR或Southern blot。

 

针对这些问题,可以采取以下措施:

 

1. 优化重组条件,包括DNA浓度、电穿孔参数、转化菌株选择等。

 

2. 优化糖筛条件,包括糖浓度、筛选时间和温度等。

 

3. 使用高质量的自杀质粒。

 

4. 对目标基因序列进行优化,如引入稳定性较高的序列。

 

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序