同源重组技术原理

同源重组技术原理：

基因敲除鼠技术是上世纪80 年代中后期基于DNA 同源重组的原理发展起来的，Capecchi 和Smithies 在1987 年根据同源重组（homologous recombination ）的原理，首次实现了ES 的外源基因的定点整合（targeted integration ），这一技术称为" 基因打靶" （gene targeting ）或" 基因敲除" （gene knockout ），利用这种ES 的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice ）; 由于这一工作，Capecchi 和Smithies 于2007 年与Evans 分享了诺贝尔医学奖。

同源重组（homologous recombination ）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA 分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组：

制作流程：

1 、Knockout 载体设计与构建
根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 片段都重组到带有标记基因( 如neo 基因，TK 基因等) 的载体上，成为重组的Knockout 载体。

2 、Knockout ES 细胞筛选
Knockout 载体测序验证正确后，将载体线性化，然后电转入ES 细胞，通过载体上的正负筛选基因获得阳性的Knockout ES 克隆。选取PCR 鉴定打靶载体正确插入的ES 基因组DNA 用于Southern Blot 鉴定，将Southern Blot 鉴定的Knockout ES 扩大培养并液氮保存。

3 、Knockout ES 细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠
扩增经鉴定插入或置换片段位置正确的Knockout ES 细胞，以囊胚显微注射的方式将一定数量的Knockout ES 细胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后将囊胚移植到假孕的小鼠子宫中。待后代小鼠出生后，通过小鼠的毛色中来源于ES 细胞毛色的比例判断嵌合程度的高低，以及该小鼠的后代中可能获得生殖系传递能力。

4 、由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系Knockout 小鼠
将嵌合体小鼠与适当品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通过PCR 方式检测小鼠是否含有打靶序列。如有，则该小鼠为具备生殖遗传能力的Knockout 小鼠(F1 代鼠)

5 、Knockout 小鼠生殖系传递鉴定
将嵌合体小鼠和适当品系野生型小鼠交配，通过后代小鼠毛色或PCR 基因型鉴定的方法验证嵌合体小鼠生殖系传递能力。