实验有害垃圾
用自杀质粒进行同源重组基因敲除,电转化后50μg/ml卡那霉素抗性板上能长,但是菌落PCR P不出来,抗性板肯定没问题,菌也验证过了不是杂菌,而且我用的是自杀质粒,理论上应该不会有空载质粒的情况(因为没法自我复制也整合不到基因组)
huarenqiang5
你这个考虑可能是质粒被细菌污染所导致。
loveliufudan
有几个可能的原因:
1. 切除事件未发生:同源重组基因敲除的关键是引导同源重组切除目标基因。如果切除事件未发生,那么目标基因仍然存在于细菌菌落中,因此无法通过PCR扩增检测到。您可以考虑检查实验中的引物设计是否正确,确保引物特异性并覆盖目标基因的预期切除位点。
2. 重组效率较低:即使引导同源重组的质粒成功转化到细菌中,重组效率也可能相对较低,导致仅有部分菌落发生了目标基因的切除。这可能导致在PCR检测时只有少数菌落呈阳性。
3. 质粒插入或重组的不完全:在自杀质粒的基因敲除策略中,质粒通常会在同源重组之后在细菌染色体中整合,并取代目标基因。然而,有时可能发生插入或重组不完全的情况,导致质粒未能完全替代目标基因。这可能是导致PCR结果阴性的原因之一。
土井挞克树
可能是质粒存在缺陷,质粒存在基因污染